L'allegato I del regolamento di esecuzione (UE) 2021/808 è così modificato:

1) il punto 1.2.1 è sostituito dal seguente:

«1.2.1. Prescrizioni generali per i metodi di conferma

Per le sostanze vietate o non autorizzate, il CCα deve essere il più basso ragionevolmente ottenibile. Per le sostanze vietate o non autorizzate per le quali è stato stabilito un valore di riferimento per interventi a norma del regolamento (UE) 2019/1871, il CCα deve essere inferiore o pari al valore di riferimento per interventi.

Per le sostanze autorizzate il CCα deve essere superiore, ma il più vicino possibile, all'LMR o all'LM.

A fini di conferma sono utilizzati solo i metodi analitici per i quali si possa dimostrare, in modo documentato e rintracciabile, che sono validati e hanno un tasso di falsi non conformi (errore α) inferiore o pari all'1 % per le sostanze vietate o non autorizzate oppure inferiore o pari al 5 % per le sostanze autorizzate.

I metodi di conferma devono fornire informazioni sulla composizione chimica e sulla struttura dell'analita. Di conseguenza, i metodi di conferma basati esclusivamente sull'analisi cromatografica senza l'uso della rivelazione tramite spettrometria di massa non sono adeguati all'impiego isolato come metodi di conferma per le sostanze farmacologicamente attive vietate o non autorizzate. Nel caso in cui la spettrometria di massa non sia adeguata per le sostanze autorizzate, possono essere utilizzati altri metodi quali HPLC-DAD e HPLC-FLD, o una combinazione di essi.

Se necessario secondo il metodo di conferma, all'inizio della procedura di estrazione si deve aggiungere all'aliquota da analizzare uno standard interno adeguato. A seconda della disponibilità, sono impiegate forme stabili dell'analita marcate con isotopi, che sono particolarmente indicate per la rivelazione con la spettrometria di massa, oppure composti analoghi strettamente correlati in modo strutturale all'analita.»;

2) tra i punti 1.2.1 e 1.2.2 è aggiunto il seguente punto 1.2.1 bis:

«1.2.1 bis. Uso specifico della co-cromatografia quando non sono disponibili standard interni

Ove non sia possibile impiegare alcuno standard interno adeguato, l'identificazione dell'analita è preferibilmente confermata dalla co-cromatografia (*). In tal caso si ottiene un solo picco, e l'altezza (o l'area) del picco ingrandito è equivalente alla quantità di analita aggiunto. Se ciò non è possibile, si devono utilizzare standard a matrice abbinata o a matrice fortificata.

3) al punto 1.2.2.2, la frase dopo la tabella 2 è sostituita dalla seguente:

«Per le analisi effettuate in condizioni di ripetibilità, il coefficiente di variazione in condizioni di ripetibilità è generalmente inferiore ai due terzi dei valori elencati nella tabella 2 e deve essere pari o inferiore al coefficiente di variazione in condizioni di riproducibilità.»;

4) il punto 1.2.3 è sostituito dal seguente:

«1.2.3. Prescrizioni relative alla separazione cromatografica

1.2.3.1. Tempo di ritenzione minimo accettabile

Per la cromatografia liquida (LC) o la gascromatografia (GC), il tempo di ritenzione minimo accettabile per l'analita o gli analiti sotto esame è pari al doppio del tempo di ritenzione corrispondente al volume vuoto della colonna.

1.2.3.2. Tempo di ritenzione dell'analita nell'estratto

Il tempo di ritenzione dell'analita nell'estratto deve corrispondere a quello dello standard di taratura, di uno standard a matrice abbinata o di uno standard a matrice fortificata con una tolleranza di ± 0,1 minuti. Per la cromatografia rapida, con un tempo di ritenzione inferiore a 2 minuti, è accettabile una deviazione inferiore al 5 % del tempo di ritenzione.

1.2.3.3. Tempo di ritenzione in caso di uso di uno standard interno

Se si usa uno standard interno, il rapporto tra il tempo di ritenzione cromatografica dell'analita e quello dello standard interno, ossia il tempo di ritenzione relativo dell'analita, deve corrispondere a quello dello standard di taratura, dello standard a matrice abbinata o dello standard a matrice fortificata con una deviazione massima dello 0,5 % per la gascromatografia e dell'1 % per la cromatografia liquida per i metodi validati a decorrere dalla data di entrata in vigore del presente regolamento.»;

5) al punto 2.1, la tabella 5 è sostituita dalla seguente:

«Tabella 5

Classificazione dei metodi analitici in base alle caratteristiche di rendimento che devono essere determinate

.

6) il punto 2.2.1 è sostituito dal seguente:

«2.2.1. Validazione convenzionale

Il calcolo dei parametri in base ai metodi convenzionali richiede l'esecuzione di svariati esperimenti singoli (cfr. la tabella 5 del presente allegato). Per le modifiche importanti è necessario verificare il mantenimento della validità delle caratteristiche di rendimento. Per i metodi ad analita multiplo è possibile analizzare contemporaneamente svariati analiti, a condizione di aver precedentemente escluso possibili interferenze pertinenti. In tal modo è possibile determinare svariate caratteristiche di rendimento. Pertanto, per ridurre il carico di lavoro è consigliabile combinare per quanto possibile gli esperimenti (ad esempio, ripetibilità e riproducibilità intralaboratorio con la specificità, analisi dei campioni bianchi per determinare il limite di decisione di conferma e prova della specificità).»;

7) al punto 2.2.1.2, punto 1, la lettera a) è sostituita dalla seguente:

«a) 0,5 (**), 1,0 e 1,5 volte il valore di riferimento per interventi; oppure 

8) il punto 2.2.1.3 è così modificato:

a) al punto 1, la lettera a) è sostituita dalla seguente:

«a) 0,5 (***), 1,0 e 1,5 volte il valore di riferimento per interventi; oppure

b) il punto 6 è sostituito dal seguente:

«6. ripetere tali passaggi in almeno altre due occasioni per un totale di almeno 18 replicati per livello;»;

9) il punto 2.2.1.4 è così modificato:

a) al punto 1, la lettera a) è sostituita dalla seguente:

«a) 0,5 (****), 1,0 e 1,5 volte il valore di riferimento per interventi; oppure

b) il punto 5 è sostituito dal seguente:

«5. Ripetere tali passaggi in almeno altre due occasioni (per un totale di almeno 18 replicati per livello) con lotti differenti di materiale bianco, operatori differenti ed in condizioni ambientali il più possibile differenti, ad esempio, lotti di reagenti o di solventi differenti ecc., temperature ambientali differenti, strumenti differenti, oppure una variazione di altri parametri ecc.»;

10) al punto 2.2.2, la frase dopo la tabella 6 è sostituita dalla seguente:

«Il calcolo delle caratteristiche del metodo deve essere effettuato come descritto da Jülicher et al. (*****) o dalla norma ISO/TS 23471:2022 (******).

11) al punto 2.5, il terzo comma è sostituito dal seguente:

«Qualora non siano disponibili i dati sulla stabilità richiesti, devono essere utilizzati gli approcci seguenti. E' inoltre possibile ricorrere all'applicazione di un approccio isocrono (*******), con uno schema di temperatura di conservazione simile a quello di cui alla tabella 7 del presente allegato, che consente di determinare le potenziali instabilità dell'analita e di effettuare una stima dei periodi di conservazione adeguati.

12) il punto 2.5.2 è sostituito dal seguente:

«2.5.2. Determinazione della stabilità dell'analita/degli analiti nella matrice

1. Quando possibile, utilizzare campioni «incurred». Ove non sia disponibile alcuna matrice «incurred», deve essere utilizzata una matrice bianca fortificata con l'analita.

2. Se è disponibile una matrice «incurred» di interesse, omogeneizzarla, preferibilmente finché è ancora fresca. Dividere la matrice in cinque porzioni e analizzare un'aliquota da ciascuna porzione.

3. Se non è disponibile alcuna matrice «incurred», prendere della matrice bianca e omogeneizzarla. Dividere la matrice in cinque porzioni. Fortificare ciascuna porzione con l'analita attorno al livello di interesse, che deve preferibilmente essere preparato in una piccola quantità di soluzione acquosa. Analizzare immediatamente un'aliquota da ciascuna porzione.

4. Conservare le porzioni (sottocampioni) della matrice «incurred» omogeneizzata o della matrice bianca fortificata a una temperatura che rifletta le condizioni di conservazione adottate nel laboratorio per una determinata associazione analita/matrice e determinare le concentrazioni dell'analita dopo la conservazione a breve, medio e lungo termine (almeno per il tempo in cui il campione è solitamente conservato in laboratorio).

5. Il valore medio di cinque aliquote di una porzione conservata non deve differire di più della riproducibilità intralaboratorio del metodo dal valore medio di cinque aliquote appena preparate. Il valore medio delle cinque aliquote appena preparate è utilizzato come base per calcolare la differenza percentuale.

6. Registrare il tempo massimo di conservazione accettabile e le condizioni ottimali di conservazione.»;

13) il punto 2.7 è così modificato:

a) al punto 1, la lettera b) è sostituita dalla seguente:

«b) metodo 2: studio del materiale bianco fortificato al livello di concentrazione della concentrazione bersaglio per lo screening scelta inizialmente. A tale livello di concentrazione devono essere analizzati 20 bianchi fortificati al fine di garantire una base affidabile per tale determinazione. Se a tale livello di concentrazione rimane ≤ 5 % di risultati falsi conformi, il livello equivale alla capacità di rivelazione del metodo. Se si ottiene > 5 % di risultati falsi conformi, la concentrazione bersaglio per lo screening scelta deve essere aumentata e lo studio ripetuto per verificare la conformità al requisito del ≤ 5 % di risultati falsi conformi.»;

b) al punto 2, il secondo comma è soppresso;

14) al punto 2.9, il primo comma è sostituito dal seguente:

«Non occorre determinare il recupero assoluto del metodo se è disponibile uno standard interno o una taratura della matrice fortificata, o se sono disponibili entrambi. In tutti gli altri casi il recupero assoluto del metodo deve essere determinato.»;

15) al punto 2.10, l'ultimo comma è sostituito dal seguente:

«Il coefficiente di variazione non deve essere superiore ai valori di cui alla tabella 2 del presente allegato per il fattore matrice (standard normalizzato per IS).»;

16) al capitolo 3, il terzo comma è sostituito dal seguente:

«Durante le analisi di routine, l'analisi dei materiali di riferimento certificati (MRC) è l'opzione preferibile per dimostrare il rendimento del metodo. Poiché raramente sono disponibili MRC che contengono gli analiti pertinenti ai livelli di concentrazione richiesti, possono essere utilizzati come alternativa anche materiali di riferimento forniti e caratterizzati dai laboratori di riferimento dell'Unione europea o dai laboratori che possiedono un accreditamento ISO/IEC 17043:2023 (********). Come ulteriore alternativa possono essere utilizzati materiali di riferimento interni, controllati periodicamente.

_______________

(*) La co-cromatografia è una procedura nella quale, prima delle fasi cromatografiche, l'estratto del campione viene diviso in due parti. Una parte viene sottoposta a cromatografia tale e quale; l'altra parte è miscelata con l'analita standard che deve essere misurato. La miscela è quindi sottoposta a cromatografia. La quantità di analita standard aggiunto deve essere simile alla quantità stimata dell'analita nell'estratto. La co-cromatografia è utilizzata per migliorare l'identificazione di un analita quando vengono impiegati metodi cromatografici, in particolare quando non si può utilizzare alcuno standard interno adeguato.»;

(**) Se, per una sostanza farmacologicamente attiva non consentita, la validazione di una concentrazione pari a 0,5 volte il valore di riferimento per interventi non è ragionevolmente ottenibile, la concentrazione di 0,5 volte il valore di riferimento per interventi può essere sostituita dalla concentrazione più bassa ragionevolmente ottenibile tra 0,5 e 1,0 volte il valore di riferimento per interventi, o dal livello minimo di taratura, se inferiore a 0,5 volte il valore di riferimento per interventi.»;

(***) Se, per una sostanza farmacologicamente attiva non consentita, la validazione di una concentrazione pari a 0,5 volte il valore di riferimento per interventi non è ragionevolmente ottenibile, la concentrazione di 0,5 volte il valore di riferimento per interventi può essere sostituita dalla concentrazione più bassa ragionevolmente ottenibile tra 0,5 e 1,0 volte il valore di riferimento per interventi, o dal livello minimo di taratura, se inferiore a 0,5 volte il valore di riferimento per interventi.»;

(****) Se, per una sostanza farmacologicamente attiva non consentita, la validazione di una concentrazione pari a 0,5 volte il valore di riferimento per interventi non è ragionevolmente ottenibile, la concentrazione di 0,5 volte il valore di riferimento per interventi può essere sostituita dalla concentrazione più bassa ragionevolmente ottenibile tra 0,5 e 1,0 volte il valore di riferimento per interventi, o dal livello minimo di taratura, se inferiore a 0,5 volte il valore di riferimento per interventi.»;

(*****) Jülicher, B., Gowik, P. e Uhlig, S. (1998), «Assessment of detection methods in trace analysis by means of a statistically based in-house validation concept». Analyst, 123, 173.

(******) ISO/TS 23471:2022 Experimental designs for evaluation of uncertainty - Use of factorial designs for determining uncertainty functions.»;

(*******) Lamberty, A., Schimmel, H. e Pauwels, J. (1998) «The study of the stability of reference materials by isochronous measurements.» Fres. J. Anal. Chem. 360, 359.»;

(********) ISO/IEC 17043:2023 Valutazione della conformità - Requisiti generali per le prove valutative interlaboratorio.».»

((+)) Un metodo di screening semiquantitativo è un metodo di screening che fornisce risultati quantitativi ma non rispetta i requisiti di precisione di cui all'allegato I, tabella 2, del presente regolamento.

(*1) Per i metodi MS occorre provare mediante validazione il rispetto delle prescrizioni relative alle caratteristiche di rendimento. L'effetto matrice relativo del metodo deve essere determinato se tale effetto non è stato valutato durante la procedura di validazione. Il recupero assoluto del metodo deve essere determinato se non si usa uno standard interno o una taratura della matrice fortificata.

((#)) Se i dati sulla stabilità degli analiti in una matrice sono disponibili nella letteratura scientifica o grazie ad un altro laboratorio, non è necessario che tali dati siano nuovamente determinati dal laboratorio interessato. Il riferimento a dati disponibili sulla stabilità degli analiti in soluzione è tuttavia accettabile solo se sono applicate condizioni identiche.";