(sostituito dall'art. 1 del Reg. (UE) n. 691/2013 e dall'art. 1 del Reg. (UE) 2024/771)

METODI DI CAMPIONAMENTO

1. FINALITA' E CAMPO DI APPLICAZIONE

I campioni destinati al controllo ufficiale degli alimenti per animali sono prelevati secondo i metodi sottoindicati. I campioni così ottenuti sono da considerarsi rappresentativi delle partite campionate.

Lo scopo del campionamento rappresentativo è prelevare una piccola frazione di un lotto in modo che la determinazione di una caratteristica specifica di tale frazione rappresenti il valore medio della caratteristica del lotto. Il campionamento avviene mediante prelievo ripetuto di campioni elementari in diversi punti del lotto. Tali campioni elementari sono mescolati per formare un campione globale, dal quale sono ricavati a loro volta dei campioni finali rappresentativi per divisione rappresentativa.

Se, a un controllo visivo o in base ad altre informazioni pertinenti, partite del mangime da sottoporre a campionamento mostrano una differenza di qualità dal resto del mangime dello stesso lotto, tali partite vengono separate dal resto del mangime e trattate come un sottolotto distinto. Qualora non fosse possibile suddividerlo in sottolotti, il mangime viene sottoposto a campionamento come lotto unico. In tali casi, ne è fatta menzione nel verbale di campionamento.

Se un mangime facente parte di un lotto di mangimi della stessa classe o con la medesima descrizione viene sottoposto a campionamento conformemente alle disposizioni del presente regolamento e risulta non conforme ai requisiti UE, si presume che i risultati valgano per tutti i mangimi di tale lotto salvo che, a seguito di una valutazione approfondita, risulti infondato ritenere che il resto del lotto non sia conforme ai requisiti UE.

Il campionamento può comprendere anche i mangimi commercializzati dagli operatori del settore dei mangimi tramite una tecnica di comunicazione a distanza conformemente all'articolo 11, paragrafo 3, del regolamento (CE) n. 767/2009 del Parlamento europeo e del Consiglio [1]. Il campionamento dei mangimi commercializzati tramite una tecnica di comunicazione a distanza è soggetto, in linea di principio, ai punti indicati nel presente allegato. Aspetti specifici del campionamento dei campioni di vendite a distanza sono descritti al punto 11.

2. DEFINIZIONI

- Lotto: quantità determinata di mangime che possiede caratteristiche comuni come l'origine, la varietà, il tipo di imballaggio, l'identità dell'imballatore, lo speditore o l'etichettatura e, nel caso di un processo produttivo, un'unità di produzione prodotta in un singolo impianto applicando parametri di produzione uniformi o più unità di produzione di questo tipo, se prodotte in ordine continuo e immagazzinate insieme.

- Partita campionata: lotto o parte identificata del lotto o del sottolotto.

- Campione sigillato: campione sigillato in modo tale da non essere accessibile senza la rottura o l'asportazione del sigillo.

- Campione elementare: quantità prelevata da un punto della partita campionata.

- Campione globale: insieme di campioni elementari prelevati da una stessa partita campionata.

- Campione ridotto: parte del campione globale ottenuta mediante riduzione rappresentativa di quest'ultimo.

- Campione finale: parte del campione globale (mescolato), del campione ridotto o del campione globale omogeneizzato, a seconda del tipo di controllo (cfr. punto 9.4).

- Campione di laboratorio: campione destinato al laboratorio (come ricevuto dal laboratorio) che può essere il campione finale, il campione ridotto o il campione globale.

- Campione di vendite a distanza: campione di un lotto di mangime commercializzato tramite una tecnica di comunicazione a distanza.

3. DISPOSIZIONI GENERALI

- I campioni sono prelevati da personale appositamente autorizzato dall'autorità competente.

- Nel caso dei campioni di vendite a distanza, l'autorità competente richiede una quantità di mangime all'operatore del settore dei mangimi tramite una comunicazione a distanza.

- Il campione è sigillato in modo tale da non essere accessibile senza la rottura o l'asportazione del sigillo.

Il marchio del sigillo è chiaramente identificabile e ben visibile.

- Identificazione del campione: il campione è contrassegnato in modo indelebile e deve essere identificato in maniera tale da essere collegato inequivocabilmente al verbale di campionamento.

- Da ciascun campione globale o campione ridotto sono prelevati i seguenti campioni finali: uno come controllo (verifica dell'applicazione della normativa) e uno per l'operatore del settore dei mangimi (campione per la difesa in caso di controversia). Infine può essere prelevato un altro campione finale come riferimento. Nel caso in cui l'intero campione globale sia omogeneizzato, i campioni finali sono prelevati dal campione globale omogeneizzato, a meno che tale procedura non sia in contrasto con le norme vigenti nello Stato membro in materia di diritti degli operatori del settore dei mangimi.

- A norma dell'articolo 15, paragrafi 1 e 2, del regolamento (UE) 2017/625, se necessario per l'esecuzione del campionamento ufficiale, gli operatori del settore dei mangimi, su richiesta dalle autorità competenti:

- concedono al personale delle autorità competenti l'accesso alle attrezzature sotto il loro controllo, anche mettendo a disposizione, se necessario, attrezzature per il campionamento e dispositivi di protezione individuale adeguati;

- forniscono assistenza e collaborano con il personale delle autorità competenti per consentire il campionamento, anche mettendo a disposizione di tale personale gli alimenti per animali.

4. STRUMENTI

4.1. Gli strumenti utilizzati per il campionamento sono realizzati con materiali che non possono contaminare i prodotti da campionare. Se destinati ad essere riutilizzati varie volte, gli strumenti sono di agevole pulizia, per evitare una contaminazione crociata.

4.2. Strumenti raccomandati per il prelievo di campioni di alimenti solidi per animali

4.2.1. Campionamento manuale 

4.2.1.1. Pala a fondo piatto e a bordi laterali verticali. 

4.2.1.2. Sonda a lungo setto o a partizioni. Le dimensioni della sonda sono adeguate alle caratteristiche della partita campionata (profondità del recipiente, misure del sacco ecc.) e alla dimensione delle particelle costituenti l'alimento.

Se la sonda presenta diverse aperture per fare sì che il campione sia prelevato in diversi punti lungo la sonda, le aperture sono separate da compartimenti o scalate in sequenza.

4.2.2. Campionamento meccanico

Per il prelievo di campioni di alimenti in flusso possono essere utilizzati strumenti meccanici appropriati. Gli strumenti meccanici sono considerati appropriati quando consentono di sottoporre a campionamento almeno l'intera sezione del flusso.

Il campionamento dei mangimi in movimento (a elevata velocità di flusso) può essere effettuato facendo uso di campionatori automatici.

4.2.3. Divisori

Se possibile e opportuno, per preparare campioni ridotti rappresentativi possono essere utilizzati strumenti che servono a dividere i campioni in parti approssimativamente uguali.

5. REQUISITI QUANTITATIVI PER QUANTO RIGUARDA IL NUMERO DI CAMPIONI ELEMENTARI

- I requisiti quantitativi di cui ai punti 5.1 e 5.2 riguardanti il numero di campioni elementari sono applicabili a partite campionate di dimensioni massime di 500 tonnellate l'una e campionabili in modo rappresentativo. La procedura di campionamento descritta è ugualmente valida per i quantitativi superiori alla dimensione massima della partita campionata se non si tiene conto del numero massimo di campioni elementari indicato nelle tabelle ai punti 5.1.1, 5.1.3 e 5.1.5; in tal caso il numero di campioni elementari è determinato dalla formula contenente la radice quadrata che figura nella parte corrispondente della procedura (cfr. punto 5.3) e la dimensione minima del campione globale aumentata in proporzione. Ciò non impedisce di suddividere un lotto grande in sottolotti più piccoli e di sottoporre a campionamento ciascun sottolotto seguendo la procedura descritta ai punti 5.1 e 5.2.

- La dimensione della partita campionata deve essere tale da consentire il prelievo di campioni in ogni sua parte.

- Nel caso dei lotti o sottolotti molto grandi (> 500 tonnellate) e dei lotti trasportati o immagazzinati in un modo che non rende possibile effettuare campionamenti seguendo la procedura di cui ai punti 5.1 e 5.2 del presente punto, si adotta la procedura di campionamento indicata al punto 5.3.

- Nel caso dei campioni di vendite a distanza, di norma l'autorità competente non conosce la dimensione del lotto per il quale è richiesto il quantitativo. La procedura di cui ai punti 5.1 e 5.2 non può pertanto essere utilizzata. In tal caso si applica la procedura descritta al punto 11.

- Qualora sia tenuto per legge a rispettare il presente regolamento nell'ambito di un sistema di monitoraggio obbligatorio, l'operatore del settore dei mangimi può discostarsi dai requisiti quantitativi di cui al presente punto al fine di tenere conto delle caratteristiche operative, purché dimostri in modo convincente all'autorità competente l'equivalenza della procedura di campionamento per quanto concerne la rappresentatività e previa autorizzazione dell'autorità competente.

- In casi eccezionali, quando non è possibile applicare i requisiti quantitativi del metodo di campionamento prescritto senza danneggiare il lotto in misura inaccettabile per il commercio (ad esempio a causa delle tipologie d'imballaggio, dei mezzi di trasporto, delle modalità di immagazzinamento ecc.), si può ricorrere a un metodo alternativo, a condizione che il campionamento sia il più rappresentativo possibile e che il metodo applicato sia chiaramente descritto e debitamente documentato.

5.1. Requisiti quantitativi concernenti i campioni elementari per il controllo delle sostanze o dei prodotti distribuiti in modo uniforme negli alimenti per animali

5.1.1. Alimenti solidi alla rinfusa

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5.1.2. Alimenti liquidi alla rinfusa

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5.1.3. Alimenti in confezioni

Gli alimenti (solidi e liquidi) possono essere confezionati in sacchetti, sacchi, barattoli, fusti ecc., ai quali si fa riferimento nella tabella seguente come «unità». Le unità grandi (≥ 500 kg o litri) si campionano in base alle disposizioni previste per gli alimenti alla rinfusa (cfr. punti 5.1.1 e 5.1.2).

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5.1.4. Alimenti minerali formellati e mattonelle di sali minerali

Occorre campionare almeno un formellato o una mattonella per partita campionata di 25 unità, fino a un massimo di quattro formellati o mattonelle.

Per i formellati o le mattonelle di peso unitario non superiore a 1 kg, il campione elementare è costituito dal contenuto di un formellato o di una mattonella.

5.1.5. Foraggi grossolani/foraggio

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5.2. Requisiti quantitativi concernenti i campioni elementari per il controllo di costituenti o sostanze presumibilmente distribuiti in modo non uniforme negli alimenti per animali

Questi requisiti quantitativi concernenti i campioni elementari si applicano nei casi seguenti:

- controllo delle aflatossine, della segale cornuta, di altre micotossine e impurità botaniche nocive nelle materie prime per alimenti per animali;

- controllo della contaminazione crociata da un costituente, incluso il materiale geneticamente modificato, o da una sostanza presumibilmente distribuita in modo non uniforme negli alimenti per animali.

Nel caso in cui l'autorità di controllo sospetti fortemente che una tale distribuzione non uniforme si presenti anche in caso di contaminazione crociata da un costituente o da una sostanza in un alimento per animali composto, si possono applicare i requisiti quantitativi indicati nella tabella che segue.

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5.3. Requisiti quantitativi relativi ai campioni elementari nel caso di lotti molto grandi

Nel caso di grandi partite campionate (> 500 tonnellate): numero di campioni elementari da prelevare = 40 campioni elementari + √ delle tonnellate per il controllo di sostanze o prodotti distribuiti in modo uniforme nell'alimento, oppure 100 campioni elementari + √ delle tonnellate per il controllo di costituenti o sostanze presumibilmente distribuiti in modo non uniforme negli alimenti per animali.

6. REQUISITI QUANTITATIVI RIGUARDANTI IL CAMPIONE GLOBALE

E' richiesto un solo campione globale per partita campionata.

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7. REQUISITI QUANTITATIVI RIGUARDANTI I CAMPIONI FINALI

Campioni finali

E' richiesta l'analisi di almeno un campione finale. L'entità del campione finale destinato all'analisi deve essere non inferiore ai quantitativi che seguono.

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8. METODO DI CAMPIONAMENTO PER LOTTI MOLTO GRANDI O LOTTI IMMAGAZZINATI O TRASPORTATI CON MODALITA' CHE NON PERMETTONO IL PRELIEVO DI CAMPIONI DA TUTTO IL LOTTO

8.1. Principi generali

Se le modalità di trasporto o di immagazzinamento di un lotto non consentono il prelievo di campioni elementari dall'intero lotto, è preferibile effettuare il campionamento quando il lotto è in movimento.

Nel caso dei grandi depositi per immagazzinare alimenti per animali, gli operatori vanno incoraggiati ad installare nel deposito attrezzature che consentano di effettuare il campionamento (automatico) su tutto il lotto immagazzinato.

In caso di applicazione delle procedure di campionamento previste dal presente punto, l'operatore del settore dei mangimi o un suo rappresentante viene informato sulla procedura di campionamento. Se contesta la procedura, l'operatore o il suo rappresentante deve consentire all'autorità competente di effettuare prelievi per il campionamento in tutto il lotto a spese dell'operatore.

8.2. Lotti grandi trasportati per nave

8.2.1. Campionamento dinamico di lotti grandi trasportati per nave

E' preferibile effettuare il campionamento di lotti grandi nelle navi quando il prodotto è in movimento (campionamento dinamico).

Il campionamento si effettua stiva per stiva (intendendo come stiva uno spazio separabile fisicamente). Le stive vengono comunque parzialmente svuotate l'una dopo l'altra, così che l'iniziale separazione fisica non sussiste più dopo il trasferimento nelle strutture di stoccaggio. Il campionamento può pertanto essere effettuato in funzione della separazione fisica iniziale o della separazione dopo il trasferimento nelle strutture di stoccaggio.

Le operazioni di scarico di una nave possono durare diversi giorni. Di norma, il campionamento deve essere effettuato a intervalli regolari durante l'intera fase di scarico. La presenza di un ispettore ufficiale per il campionamento durante l'intera operazione di scarico non è tuttavia sempre possibile o opportuna. E' pertanto consentito il campionamento di una parte (partita campionata) dell'intero lotto. Il numero di campioni elementari è determinato tenendo conto delle dimensioni della partita campionata.

In caso di campionamento di una parte di un lotto di mangimi della stessa classe o con la medesima descrizione e se tale parte del lotto non è risultata conforme ai requisiti UE, si presume che i risultati valgano per tutti i mangimi di tale lotto salvo che, a seguito di una valutazione approfondita, risulti infondato ritenere che il resto del lotto non sia conforme ai requisiti UE.

La presenza di un ispettore è necessaria anche quando il campione ufficiale è prelevato automaticamente. Tuttavia, nel caso in cui il campionamento sia effettuato in modo automatico con parametri prefissati non modificabili nel corso dello stesso e i campioni elementari siano posti in un recipiente sigillato, così da prevenire possibili frodi, la presenza di un ispettore è richiesta solo all'inizio del campionamento, ogni volta che il recipiente dei campioni deve essere cambiato e alla fine del campionamento.

8.2.2. Campionamento statico di lotti trasportati per nave

Se il campionamento è eseguito in modo statico, si applica la stessa procedura prevista per le strutture di stoccaggio (sili) accessibili dall'alto (cfr. punto 8.4.1).

Il campionamento si effettua sulla parte accessibile (dall'alto) del lotto/della stiva. Il numero di campioni elementari è determinato tenendo conto delle dimensioni della partita campionata. In caso di campionamento di una parte di un lotto di mangimi della stessa classe o con la medesima descrizione e se tale parte del lotto non è risultata conforme ai requisiti UE, si presume che i risultati valgano per tutti i mangimi di tale lotto salvo che, a seguito di una valutazione approfondita, risulti infondato ritenere che il resto del lotto non sia conforme ai requisiti UE.

8.3. Campionamento di lotti grandi immagazzinati in depositi

Il campionamento si effettua sulla parte accessibile del lotto. Il numero di campioni elementari è determinato tenendo conto delle dimensioni della partita campionata. In caso di campionamento di una parte di un lotto di mangimi della stessa classe o con la medesima descrizione e se tale parte del lotto non è risultata conforme ai requisiti UE, si presume che i risultati valgano per tutti i mangimi di tale lotto salvo che, a seguito di una valutazione approfondita, risulti infondato ritenere che il resto del lotto non sia conforme ai requisiti UE.

8.4. Campionamento di strutture di stoccaggio (sili)

8.4.1. Campionamento di sili (facilmente) accessibili dall'alto

Il campionamento si effettua sulla parte accessibile del lotto. Il numero di campioni elementari è determinato tenendo conto delle dimensioni della partita campionata. In caso di campionamento di una parte di un lotto di mangimi della stessa classe o con la medesima descrizione e se tale parte del lotto non è risultata conforme ai requisiti UE, si presume che i risultati valgano per tutti i mangimi di tale lotto salvo che, a seguito di una valutazione approfondita, risulti infondato ritenere che il resto del lotto non sia conforme ai requisiti UE.

8.4.2. Campionamento di sili non accessibili dall'alto (chiusi)

8.4.2.1. Sili non accessibili dall'alto (chiusi) di dimensioni > 100 tonnellate

Il mangime immagazzinato in siffatti sili non è campionabile in modo statico. Pertanto, qualora si debba campionare il mangime che si trova all'interno del silo e non vi sia possibilità di spostare la spedizione, occorre accordarsi con l'operatore affinché questi informi l'ispettore su quando sarà svuotato il silo, di modo che il campionamento possa essere eseguito con il mangime in movimento.

8.4.2.2. Sili non accessibili dall'alto (chiusi) di dimensioni < 100 tonnellate

La procedura di campionamento prevede che si inserisca in un recipiente un quantitativo compreso fra 50 e 100 kg e che si prelevi da esso il campione. Le dimensioni del campione globale corrispondono alla totalità del lotto e il numero dei campioni elementari alla quantità tratta dal silo e immessa nel recipiente per il campionamento. In caso di campionamento di una parte di un lotto di mangimi della stessa classe o con la medesima descrizione e se tale parte del lotto non è risultata conforme ai requisiti UE, si presume che i risultati valgano per tutti i mangimi di tale lotto salvo che, a seguito di una valutazione approfondita, risulti infondato ritenere che il resto del lotto non sia conforme ai requisiti UE.

8.5. Campionamento di alimenti alla rinfusa in grandi contenitori chiusi

Spesso tali lotti sono campionabili solo dopo essere stati scaricati. In certi casi non è possibile scaricare presso il punto di importazione o di controllo, per cui il campionamento va eseguito al momento dello scarico dei contenitori.

9. ISTRUZIONI RELATIVE AI PRELIEVI, ALLA FORMAZIONE E ALL'IMBALLAGGIO DEI CAMPIONI

9.1. Indicazioni generali

Prelevare e formare i campioni senza inutili ritardi, prendendo le precauzioni necessarie per evitare qualsiasi alterazione o contaminazione del prodotto. Le superfici, i recipienti e gli strumenti impiegati devono essere puliti e asciutti.

9.2. Campioni elementari

I campioni elementari vanno prelevati a caso e in modo uniforme dall'insieme della partita campionata, e devono essere approssimativamente delle stesse dimensioni.

Il campione elementare è pari ad almeno 100 grammi o a 25 grammi in caso di foraggio grossolano/foraggio a bassa densità specifica.

Qualora siano da prelevare meno di 40 campioni elementari, conformemente alle norme procedurali per il campionamento fissate al punto 8, le dimensioni di tali campioni sono determinate in funzione delle dimensioni prescritte per il campione globale da ottenere (cfr. punto 6).

In caso di campionamento di piccoli lotti di mangime confezionato da cui, in base ai requisiti quantitativi, sia da prelevare un numero limitato di campioni elementari, il campione elementare è dato dal contenuto di un'unità originaria di peso non superiore a 1 kg o di volume non superiore a un litro.

Per i campionamenti di mangime confezionato composto da piccole unità (ad esempio < 250 g), le dimensioni del campione elementare dipendono dalle dimensioni dell'unità.

Nel caso dei campioni di vendite a distanza, le dimensioni del campione elementare dipendono dalle dimensioni dell'unità e possono essere anche inferiori a 100 g o 100 ml in singoli casi.

9.2.1. Alimenti alla rinfusa

Eventualmente si può procedere al campionamento al momento della messa in movimento della partita campionata (carico o scarico).

9.2.2. Alimenti in confezioni

Dopo aver selezionato il numero prescritto di unità da campionare secondo quanto indicato al punto 5, prelevare con una sonda o con una pala una parte del contenuto di ciascuna di tali unità. All'occorrenza svuotare separatamente le unità.

9.2.3. Alimenti liquidi o semiliquidi omogenei o omogeneizzabili

Dopo aver selezionato il numero prescritto di unità da campionare secondo quanto indicato al punto 5, prelevare una parte del contenuto di ciascuna unità, se necessario dopo omogeneizzazione.

I campioni elementari possono eventualmente essere prelevati al momento del travaso del prodotto.

9.2.4. Alimenti liquidi o semiliquidi non omogeneizzabili

Dopo aver selezionato il numero prescritto di unità da campionare secondo quanto indicato al punto 5, prelevare i campioni a diversi livelli.

I campioni possono essere prelevati anche al momento del travaso del prodotto, dopo eliminazione delle prime frazioni.

In entrambi i casi, il volume totale dei prelievi non deve essere inferiore a 10 litri.

9.2.5. Alimenti minerali formellati e mattonelle di sali minerali

Dopo aver selezionato il numero prescritto di formellati o mattonelle da campionare secondo quanto indicato al punto 5, prelevare una parte da ciascun formellato o da ciascuna mattonella. Se si ha il sospetto che un formellato o una mattonella non sia omogeneo/a, è possibile prelevare come campione l'intero formellato o l'intera mattonella.

Per i formellati o le mattonelle di peso unitario non superiore a 1 kg, il campione elementare è costituito dal contenuto di un formellato o di una mattonella.

9.3. Formazione dei campioni globali

Mescolare i campioni elementari per costituire un unico campione globale.

9.4. Formazione dei campioni finali

Il materiale del campione globale va mescolato con cura [2].

Introdurre ciascun campione in un contenitore/recipiente idoneo. Prendere tutte le precauzioni del caso per evitare qualsiasi modifica della composizione del campione o qualsiasi contaminazione o alterazione fortuita durante il trasporto o lo stoccaggio.

9.4.1. Sostanze distribuite in modo uniforme

In caso di controllo di costituenti o sostanze distribuiti in modo uniforme nell'alimento, il campione globale può essere ridotto in modo rappresentativo a non meno di 2,0 kg o 2,0 litri (campione ridotto) [3], possibilmente facendo uso di un divisore meccanico o automatico. Per la verifica della presenza di residui di antiparassitari nei legumi, nei cereali in grani e nella frutta a guscio, il campione ridotto deve essere di almeno 3 kg. Se la natura dell'alimento non consente di utilizzare un divisore o se non si dispone di un divisore, si può ridurre il campione con il metodo della suddivisione in quarti.

Dal campione globale o dai campioni ridotti sono quindi prelevati campioni finali (per controllo, difesa in caso di controversia ed eventualmente riferimento) di entità approssimativamente uguale e rispondenti ai requisiti quantitativi di cui al punto 7.

9.4.2. Sostanze distribuite in modo non uniforme

Se si controllano costituenti, incluso il materiale geneticamente modificato, o sostanze presumibilmente distribuiti in modo non uniforme negli alimenti per animali, il campione globale sarà:

i) interamente omogeneizzato. Dal campione globale omogeneizzato sono quindi prelevati campioni finali (per controllo, difesa in caso di controversia ed eventualmente riferimento) di entità approssimativamente uguale e rispondenti ai requisiti quantitativi di cui al punto 7; o

ii) ridotto a non meno di 2 kg o 2 litri [4] servendosi di un divisore meccanico o automatico. Solo se la natura dell'alimento non consente di utilizzare un divisore si può ridurre il campione, qualora necessario, con il metodo della suddivisione in quarti. Per la verifica della presenza di materiale geneticamente modificato nel quadro del regolamento (UE) n. 619/2011, il campione ridotto deve contenere almeno 35 000 semi/grani per permettere di ottenere campioni finali di almeno 10 000 semi/grani ai fini di verifica dell'applicazione della normativa, per la difesa in caso di controversia ed eventualmente come riferimento (cfr. nota (**) al punto 6 e nota (*) al punto 7).

Dal campione ridotto sono quindi prelevati campioni finali di entità approssimativamente uguale e rispondenti ai requisiti quantitativi di cui al punto 7.

9.5. Imballaggio dei campioni

Sigillare ed etichettare i recipienti o le confezioni in modo che non possano essere aperti senza violare il sigillo. L'etichetta completa deve essere incorporata nel sigillo. In alternativa, il campione può essere messo in un recipiente che, una volta chiuso, non possa essere aperto senza danneggiarsi irreparabilmente e non possa quindi essere riutilizzato.

9.6. Invio dei campioni al laboratorio

Il campione deve essere inviato senza indugio al laboratorio di analisi designato. Con esso vanno inviate anche le informazioni necessarie all'analista.

10. VERBALI DI CAMPIONAMENTO

Per ogni campione va redatto un verbale che permetta di identificare in modo univoco la partita campionata e le sue dimensioni.

Il verbale deve anche recare nota di ogni eventuale scostamento rispetto alla procedura di campionamento prevista dal presente regolamento.

Il verbale va messo a disposizione, oltre che del laboratorio di controllo ufficiale, dell'operatore del settore dei mangimi e/o del laboratorio designato dall'operatore del settore dei mangimi.

11. CAMPIONE DI VENDITE A DISTANZA

- Nel caso dei campioni di vendite a distanza, l'alimento per animali è richiesto all'operatore del settore dei mangimi tramite tecniche di comunicazione a distanza. In tal caso, quando richiede l'alimento per animali l'autorità competente non è tenuta a identificarsi con un'identità ufficiale dinanzi all'operatore del settore dei mangimi e può utilizzare un'identità di copertura.

- Il campione globale e i campioni finali del campione di vendite a distanza devono essere prelevati da personale appositamente autorizzato immediatamente dopo il ricevimento della spedizione. Per generare il campione globale occorre prelevare a caso e in modo uniforme un numero adeguato di campioni elementari dalla quantità totale ottenuta e miscelarli/omogeneizzarli con attenzione, conformemente, per quanto possibile, ai principi di cui al punto 5 e ai punti 9.2 e 9.3. Se l'alimento per animali è confezionato in singole unità, si devono ottenere almeno 4 unità dalle quali deve essere prelevato almeno un campione elementare. Qualora sia dimostrato, caso per caso, che le unità ottenute provengono da lotti diversi, il numero di unità da campionare deve essere ridotto e limitato alle unità provenienti dallo stesso lotto. In caso di analisi del campione di vendite a distanza per costituenti o sostanze distribuiti in modo non uniforme nell'alimento per animali, il numero di campioni elementari deve essere almeno 2,5 volte superiore rispetto al numero dei campioni analizzati per sostanze distribuite in modo uniforme in tutto l'alimento per animali.

Dal campione globale sono dunque prelevati i corrispondenti campioni finali (per controllo, difesa in caso di controversia ed eventualmente riferimento) conformemente, per quanto possibile, ai principi di cui al punto 9.4 e il verbale di campionamento indica che si tratta di un campione di vendite a distanza. L'autorità competente informa quindi immediatamente del campionamento l'operatore del settore dei mangimi. L'operatore del settore dei mangimi è inoltre informato che un campione (per difesa in caso di controversia) è tenuto, ove possibile, a sua disposizione dall'autorità competente in un determinato luogo a fini di difesa in caso di controversia o inviato all'operatore del settore dei mangimi o inviato al laboratorio designato dall'operatore del settore dei mangimi conformemente alle norme nazionali in vigore.

Se il campione è inviato direttamente al laboratorio ufficiale, il campione finale deve essere preparato e sigillato in laboratorio da personale appositamente autorizzato o in presenza di personale appositamente autorizzato. Il verbale di campionamento del campione di vendite a distanza deve essere inviato immediatamente dopo la formazione dei campioni finali all'autorità competente, che informa del campionamento l'operatore del settore dei mangimi.

Si ritiene che la quantità fornita dall'operatore del settore dei mangimi all'autorità competente rappresenti una parte di un lotto di alimenti per animali della stessa classe o con la medesima descrizione. Conformemente all'articolo 15 del regolamento (CE) n. 178/2002 del Parlamento europeo o del Consiglio [5], se tale parte del lotto è risultata non conforme ai requisiti UE, si presume, anche nel caso di un campione di vendite a distanza, che i risultati valgano per tutti i mangimi di tale lotto salvo che, a seguito di una valutazione approfondita (se del caso nel corso di un'ispezione in loco), risulti infondato ritenere che il resto del lotto non sia conforme ai requisiti UE.

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[1] Regolamento (CE) n. 767/2009 del Parlamento europeo e del Consiglio, del 13 luglio 2009, sull'immissione sul mercato e sull'uso dei mangimi, che modifica il regolamento (CE) n. 1831/2003 e che abroga le direttive 79/373/CEE del Consiglio, 80/511/CEE della Commissione, 82/471/CEE del Consiglio, 83/228/CEE del Consiglio, 93/74/CEE del Consiglio, 93/113/CE del Consiglio e 96/25/CE del Consiglio e la decisione 2004/217/CE della Commissione (GU L 229 dell'1.9.2009).

(*1) Se il risultato è un numero decimale, si arrotonda al numero intero superiore.

(*2) Nel caso in cui non sia possibile rendere omogeneo il liquido, il numero di campioni elementari deve essere aumentato.

(*3) Qualora l'apertura di un'unità possa alterare i risultati dell'analisi (per esempio nel caso degli alimenti umidi deperibili), il campione elementare è costituito dall'unità non aperta.

(*4) Per le unità di contenuto non superiore a 1 kg o a un litro, il campione elementare è costituto dal contenuto di un'unità originaria.

(*5) Se il risultato è un numero decimale, si arrotonda al numero intero superiore.

(*6) Si riconosce che in determinate situazioni (ad esempio nel caso degli insilati) non è possibile prelevare i necessari campioni elementari senza provocare danni inaccettabili al lotto. In tali situazioni può essere applicato un metodo di campionamento alternativo; per il campionamento di questo tipo di lotti è stata elaborata una guida, disponibile all'indirizzo https://food.ec.europa.eu/system/files/2016-10/animal-feed-guidance_documents_691_2013_en.pdf.

(*7) Se il risultato è un numero decimale, si arrotonda al numero intero superiore.

(*8) Se l'alimento da sottoporre a campionamento ha un valore elevato, si può prelevare una quantità inferiore di campione globale, purché ciò sia indicato e documentato nel verbale di campionamento.

(*9) Conformemente alle disposizioni del regolamento (UE) n. 619/2011 della Commissione, del 24 giugno 2011, che fissa i metodi di campionamento e di analisi per i controlli ufficiali degli alimenti per animali riguardo alla presenza di materiale geneticamente modificato per il quale sia in corso una procedura di autorizzazione o la cui autorizzazione sia scaduta (GU L 166 del 25.6.2011), il campione globale per la verifica della presenza di materiale geneticamente modificato deve contenere almeno 35 000 semi/grani. Ciò significa che per il mais il campione globale deve essere pari ad almeno 10,5 kg e per la soia a 7 kg. Per altri semi e grani come orzo, miglio, avena, riso, segale, frumento e colza, il campione globale di 4 kg corrisponde a più di 35 000 semi/grani.

(*10) Nel caso degli alimenti confezionati, è possibile che le dimensioni delle singole unità non consentano di prelevare 4 kg per il campione globale.

(*11) Qualora si tratti di foraggio grossolano/foraggio a bassa densità specifica (ad esempio fieno o paglia), il campione globale deve essere di almeno 1 kg.

(*12) Conformemente alle disposizioni del regolamento (UE) n. 619/2011, il campione finale per la verifica della presenza di materiale geneticamente modificato deve contenere almeno 10 000 semi/grani. Ciò significa che per il mais il campione finale deve essere pari ad almeno 3 000 g e per la soia a 2 000 g. Per altri semi e grani come orzo, miglio, avena, riso, segale, frumento e colza, il campione finale di 500 g corrisponde a più di 10 000 semi/grani.

(*13) Se le dimensioni del campione globale sono considerevolmente inferiori a 4 kg o litri (cfr. note al punto 6), si può prelevare anche una quantità inferiore di campione finale, purché ciò sia indicato e documentato nel verbale di campionamento.

(*14) Nel caso del campionamento di legumi, cereali in grani e frutta a guscio per determinare i residui di antiparassitari, il campione finale deve essere di almeno 1 kg, conformemente alle disposizioni della direttiva 2002/63/CE della Commissione, dell'11 luglio 2002, che stabilisce metodi comunitari di campionamento ai fini del controllo ufficiale dei residui di antiparassitari sui e nei prodotti alimentari di origine vegetale e animale e che abroga la direttiva 79/700/CEE (GU L 187, 16.7.2002).

(*15) In caso di esame mediante ispezione visiva o al microscopio, l'entità del campione finale da esaminare è di 1 kg.

[2] Eventuali grumi vanno schiacciati, se necessario togliendoli dalla massa per poi reintegrarveli.

[3] Ad eccezione del foraggio grossolano/foraggio a bassa densità specifica.

[4] Ad eccezione del foraggio grossolano/foraggio a bassa densità specifica.

[5] Regolamento (CE) n. 178/2002 del Parlamento europeo e del Consiglio, del 28 gennaio 2002, che stabilisce i principi e i requisiti generali della legislazione alimentare, istituisce l'Autorità europea per la sicurezza alimentare e fissa procedure nel campo della sicurezza alimentare (GU L 31 dell'1.2.2002).

(sostituito dall'art. 1 del Reg. (UE) n. 691/2013 e dall'art. 1 del Reg. (UE) 2024/771)

DISPOSIZIONI GENERALI RELATIVE AI METODI DI ANALISI DEGLI ALIMENTI PER ANIMALI

A. PREPARAZIONE DEI CAMPIONI PER LE ANALISI

1. Finalità

Le procedure descritte nel presente allegato riguardano la preparazione per l'analisi dei campioni, trasmessi ai laboratori di controllo dopo essere stati prelevati conformemente alle diposizioni di cui all'allegato I.

La preparazione dei campioni di laboratorio deve assicurare che le quantità pesate previste dai metodi di analisi siano omogenee e rappresentative dei campioni finali.

Oltre alle procedure descritte nel presente allegato, devono essere seguite le linee guida per la preparazione del campione di cui alla norma EN ISO 6498.

2. Precauzioni

La procedura da seguire per la preparazione dei campioni dipende dai metodi di analisi impiegati e dai costituenti o dalle sostanze da controllare. E' pertanto di fondamentale importanza che la procedura prescelta sia adeguata al metodo di analisi applicato e ai costituenti o alle sostanze da controllare.

Effettuare tutte le operazioni in modo da evitare, nei limiti del possibile, di contaminare il campione o di modificarne la composizione.

Effettuare le macinazioni, le miscelazioni e le setacciature senza ritardi, esponendo il meno possibile il campione all'aria e alla luce. Evitare l'impiego di mulini o attrezzature per la macinazione che potrebbero riscaldare eccessivamente il campione.

Per gli alimenti particolarmente sensibili al calore si raccomanda la macinazione manuale. Assicurarsi altresì che l'apparecchiatura in sé stessa non costituisca una fonte di contaminazione.

L'omogeneizzazione del campione ottenuta preparando una sospensione mediante miscelazione ad alto taglio con acqua ha dimostrato di fornire in alcuni casi sottocampioni più omogenei rispetto alla macinazione/omogeneizzazione a secco, in particolare nel caso di sostanze chimiche distribuite in modo eterogeneo. Tuttavia anche con l'omogeneizzazione mediante una sufficiente macinazione a secco potrebbero essere ottenuti sottocampioni omogenei.

In alcuni casi, ad esempio per la determinazione della segale cornuta, di impurità botaniche nocive ecc., l'omogeneizzazione del campione non può essere effettuata mediante macinazione, ma richiede una miscelazione sufficiente del campione.

Se il campione non può essere preparato senza causare una variazione sensibile del contenuto di umidità, quest'ultimo va determinato prima e dopo la preparazione, secondo il metodo previsto nell'allegato III, parte A.

3. Procedura

3.1. Procedura generale

L'aliquota è prelevata dal campione finale omogeneizzato. Il metodo del cono e della quartatura è sconsigliato, in quanto può dar luogo ad aliquote con un elevato errore di ripartizione.

3.1.1. Alimenti che possono essere macinati direttamente

- Mescolare il campione finale e raccoglierlo in un recipiente appropriato pulito e asciutto, provvisto di chiusura ermetica. Mescolare di nuovo, al fine di garantire che l'omogeneizzazione sia completa, immediatamente prima di prelevare la quantità da analizzare (aliquota).

3.1.2. Alimenti che possono essere macinati dopo essiccazione

- Salvo diversa indicazione specifica nei metodi di analisi, essiccare il campione finale, in modo da portarne il contenuto di umidità a un livello compreso tra l'8 e il 12 %, applicando la procedura di preessiccazione indicata al punto 4.3 del metodo di dosaggio dell'umidità menzionato nell'allegato III, parte A. Procedere quindi come indicato al punto 3.1.1.

3.1.3. Alimenti liquidi o semiliquidi

- Raccogliere il campione finale in un recipiente appropriato pulito e asciutto, provvisto di chiusura ermetica. Mescolare bene, al fine di garantire che l'omogeneizzazione sia completa, immediatamente prima di prelevare la quantità da analizzare (aliquota).

3.1.4. Altri alimenti

- Se i campioni finali non possono essere preparati secondo una delle procedure di cui sopra, applicare qualsiasi altra procedura di preparazione che consenta di ottenere quantità da analizzare (aliquote) omogenee e rappresentative dei campioni finali.

3.2. Procedura specifica in caso di esame mediante ispezione visiva o al microscopio o nei casi in cui sia omogeneizzato l'intero campione globale

- In caso di esame mediante ispezione visiva (senza uso del microscopio), si adopera l'intero campione globale o campione finale.

- In caso di esame al microscopio, il laboratorio può ridurre il campione globale o ridurre ulteriormente il campione ridotto. I campioni finali per la difesa in caso di controversia ed eventualmente di riferimento si prelevano seguendo una procedura equivalente a quella seguita per il campione finale ai fini di verifica dell'applicazione della normativa.

- Qualora l'intero campione globale sia omogeneizzato, i campioni finali si prelevano dal campione globale omogeneizzato.

- Per la determinazione della segale cornuta e di impurità botaniche nocive, il campione finale deve essere suddiviso in 2 sottocampioni di peso uguale pari a circa 500 grammi. Si procede all'esame di un sottocampione. Se il risultato relativo al sottocampione è pari o inferiore al 50 % (soglia analitica) del livello massimo, il campione è conforme al livello massimo. Se il risultato è superiore al 50 % del livello massimo, occorre esaminare un altro sottocampione e la media dei risultati dei 2 sottocampioni è utilizzata per verificare la conformità al livello massimo.

4. Conservazione e immagazzinamento dei campioni

Conservare i campioni a una temperatura tale da non alterare la loro composizione. Nel caso dei campioni destinati all'analisi di vitamine o di sostanze particolarmente sensibili alla luce, conservarli in modo tale che non vengano alterati dalla luce.

B. DISPOSIZIONI CONCERNENTI I REATTIVI E L'APPARECCHIATURA DA UTILIZZARE NEI METODI DI ANALISI 

1. Tutti i reattivi, in mancanza di altre indicazioni specificate nei metodi di analisi, devono essere puri per analisi (p.a.). Per l'analisi degli elementi in traccia, la purezza dei reattivi deve essere controllata con una prova in bianco. A seconda del risultato ottenuto, può rendersi necessaria una purificazione supplementare dei reattivi. 

2. Per le operazioni di dissoluzione, diluizione, risciacquo o lavaggio, menzionate nei metodi di analisi senza indicazioni riguardo alla natura del solvente o del diluente, deve essere utilizzata acqua. Di norma, l'acqua deve essere demineralizzata o distillata. In casi particolari, indicati nei metodi di analisi, deve essere sottoposta a procedure specifiche di purificazione. 

3. Tenuto conto dell'abituale equipaggiamento dei laboratori di controllo, l'apparecchiatura descritta nei metodi di analisi si limita agli strumenti e agli apparecchi speciali o rispondenti a prescrizioni d'uso specifiche. Detto materiale deve essere pulito, soprattutto per le determinazioni di quantità minime di sostanze.

C. APPLICAZIONE DEI METODI DI ANALISI ED ESPRESSIONE DEI RISULTATI

1. Procedura di estrazione

Diversi metodi determinano una procedura di estrazione specifica. In linea di massima, è possibile applicare procedure di estrazione diverse da quella indicata nel metodo, a condizione che abbiano dimostrato un'efficienza di estrazione, per la matrice analizzata, equivalente a quella della procedura indicata nel metodo.

2. Procedura di purificazione

Diversi metodi determinano una procedura di purificazione specifica. In linea di massima, è possibile applicare procedure di purificazione diverse da quella indicata nel metodo, a condizione che abbiano dimostrato di produrre risultati, per la matrice analizzata, equivalenti a quelli prodotti dalla procedura indicata nel metodo.

3. Numero di determinazioni

Qualora si analizzino sostanze indesiderabili, se il risultato della prima determinazione risulta significativamente (> 50 %) inferiore al valore della specifica oggetto di controllo, non è necessario procedere a ulteriori determinazioni, a condizione che si applichino le procedure appropriate in materia di qualità. In altri casi, è necessaria una doppia analisi (seconda determinazione) per escludere la possibilità di una contaminazione crociata interna o di uno scambio accidentale dei campioni. La media delle due determinazioni è utilizzata per un'ulteriore valutazione.

Nel caso del controllo dei livelli minimi o massimi degli additivi per mangimi, se i risultati della prima determinazione sono al di sopra del livello minimo o al di sotto del livello massimo, non è necessario procedere a ulteriori determinazioni, a condizione che si applichino le procedure appropriate in materia di qualità. In altri casi, è necessaria una doppia analisi (seconda determinazione) per escludere la possibilità di una contaminazione crociata interna o di uno scambio accidentale dei campioni. La media delle due determinazioni è utilizzata per un'ulteriore valutazione.

Se, nel controllare il contenuto dichiarato di una sostanza o di un dato ingrediente, il risultato della prima determinazione conferma il contenuto dichiarato (ossia, lo scarto tra il risultato dell'analisi e il contenuto dichiarato rientra in un margine di variazione accettabile), non è necessario procedere a ulteriori determinazioni, a condizione che si applichino le procedure appropriate in materia di qualità. In altri casi, è necessaria una doppia analisi (seconda determinazione) per escludere la possibilità di una contaminazione crociata interna o di uno scambio accidentale dei campioni. La media delle due determinazioni è utilizzata per un'ulteriore valutazione (lo scarto tra il risultato dell'analisi e il contenuto dichiarato rientra o no in un margine di variazione accettabile).

In alcuni casi questo margine di variazione accettabile è definito in atti legislativi quali il regolamento (CE) n. 767/2009 e il regolamento (UE) 2019/4 del Parlamento europeo e del Consiglio. [1]

4. Comunicazione del metodo di analisi applicato

Il rapporto di prova deve indicare il metodo di analisi applicato.

5. Comunicazione del risultato dell'analisi

Il risultato deve essere espresso secondo le indicazioni fornite nel metodo di analisi con un numero appropriato di cifre significative e, ove necessario, corretto in funzione del contenuto di umidità del campione finale prima della sua preparazione.

La maggior parte dei livelli regolamentari (ad esempio livello massimo, livello minimo) nella legislazione dell'UE in materia di alimenti per animali è stabilita in relazione a un mangime con un contenuto di umidità del 12 %. Pertanto in questi casi, al fine di valutare il risultato dell'analisi misurato sul campione rispetto al livello regolamentare, occorre innanzitutto dividere il risultato dell'analisi per il contenuto di materia secca del campione (in %) moltiplicato per 88, come indicato nella formula che segue:

R_12% = 88R_ana / 100-Mc 

dove:

Mc: contenuto di umidità del campione (in %). 100 - Mc rappresenta quindi il contenuto di materia secca del campione (in %);

R_ana: risultato dell'analisi misurato sul campione;

R_12 %: risultato per un mangime con un contenuto di umidità del 12 %; da valutare rispetto al livello regolamentare.

Inoltre, se sono soddisfatte le condizioni seguenti:

- il risultato dell'analisi è significativamente (> 50 %) inferiore o superiore alle specifiche/informazioni sull'etichettatura da controllare (a seconda che le specifiche/informazioni sull'etichettatura riguardino un livello massimo o minimo);

- il contenuto di umidità dell'alimento campionato è noto e si può stabilire che la correzione del contenuto di umidità non modificherà la valutazione,

allora, a condizione che si applichino le procedure appropriate in materia di qualità e l'analisi serva unicamente a verificare la conformità alle norme giuridiche pertinenti, la correzione del contenuto di umidità può essere omessa (ad esempio nei casi in cui non esistono specifiche o livelli regolamentari), a meno che non sia necessaria per l'interpretazione.

Se il risultato dell'analisi è corretto in funzione del contenuto di umidità, anche l'incertezza di misura corrispondente deve essere corretta nell'ambito della stessa procedura.

In caso di determinazione della segale cornuta o di impurità botaniche nocive mediante esame visivo/al microscopio, non è necessario correggere il contenuto di umidità.

6. Incertezza di misura analitica e tasso di recupero in caso di analisi di sostanze indesiderabili

Per quanto riguarda le sostanze indesiderabili ai sensi della direttiva 2002/32/CE, un prodotto destinato all'alimentazione animale è considerato non conforme al contenuto massimo fissato quando il risultato dell'analisi come media di due determinazioni indipendenti, relativo a un alimento con un contenuto di umidità del 12 %, è giudicato superiore al contenuto massimo, tenuto conto dell'incertezza di misura analitica estesa, calcolata per mezzo di un fattore di copertura 2 corrispondente a un livello di fiducia del 95 % circa, e della correzione per il recupero. Ciò significa che, al fine di valutare la conformità, si utilizza la concentrazione risultante dall'analisi, corretta per il fattore di recupero e dopo aver dedotto l'incertezza di misura analitica estesa. Questa procedura è applicabile solo nei casi in cui il metodo di analisi consente di stimare l'incertezza di misura analitica estesa e la correzione per il recupero (ad esempio non è richiesta in caso di esame visivo/al microscopio).

Se il risultato dell'analisi del campione prelevato per la difesa in caso di controversia è superiore al contenuto massimo (senza tener conto dell'incertezza di misura analitica estesa), ciò conferma la non conformità accertata con il campione di controllo, in assenza di norme nazionali specifiche in materia.

Il risultato dell'analisi è riportato come segue (quando il metodo di analisi consente di stimare l'incertezza di misura analitica estesa):

a) con correzione per il recupero, ove opportuno e pertinente, che qualora sia applicata deve essere indicata. Il tasso di recupero deve essere indicato a meno che la correzione intrinseca per distorsione faccia parte della procedura, ove la distorsione è la differenza tra il valore misurato e la concentrazione di riferimento. La correzione non è necessaria nel caso in cui il tasso di recupero sia compreso tra 90 e 110 %;

b) nella forma «x +/- U», dove x è il risultato dell'analisi e U l'incertezza di misura analitica estesa, calcolata per mezzo di un fattore di copertura 2 [2] corrispondente a un livello di fiducia del 95 % circa.

Tuttavia, qualora il risultato dell'analisi risulti significativamente (> 50 %) inferiore al valore della specifica oggetto di controllo, e a condizione che si applichino le procedure appropriate in materia di qualità e l'analisi serva unicamente a verificare la conformità alle norme giuridiche pertinenti, il tasso di recupero e l'incertezza di misura analitica estesa possono essere omessi (ad esempio nei casi in cui non esistono specifiche o livelli regolamentari), a meno che l'incertezza di misura non sia necessaria per l'interpretazione.

7. Incertezza di misura analitica e tasso di recupero in caso di analisi del contenuto di additivi per mangimi

Al fine di verificare la conformità ai contenuti minimi e massimi autorizzati degli additivi per mangimi, la presenza di un additivo per mangimi deve essere considerata non conforme ai contenuti minimi e massimi stabiliti se si ritiene che il risultato dell'analisi come media di due determinazioni indipendenti, relativo a un mangime con un contenuto di umidità del 12 %:

- sia superiore al contenuto massimo, tenuto conto dell'incertezza di misura analitica estesa e della correzione per il recupero. Ciò significa che, al fine di valutare la conformità, si utilizza la concentrazione risultante dall'analisi (ossia la media di due determinazioni), corretta per il fattore di recupero e dopo aver dedotto l'incertezza di misura analitica estesa;

- sia inferiore al contenuto minimo, tenuto conto dell'incertezza di misura analitica estesa e della correzione per il recupero. Ciò significa che, al fine di valutare la conformità, si utilizza la concentrazione risultante dall'analisi (ossia la media di due determinazioni), corretta per il fattore di recupero e dopo aver sommato l'incertezza di misura analitica estesa.

Se il risultato dell'analisi del campione prelevato per la difesa in caso di controversia è superiore al contenuto massimo (senza tener conto dell'incertezza di misura analitica estesa), ciò conferma la non conformità accertata con il campione di controllo, in assenza di norme nazionali specifiche in materia.

Il risultato dell'analisi è riportato come segue (quando il metodo di analisi consente di stimare l'incertezza di misura analitica estesa):

a) con correzione per il recupero, ove opportuno e pertinente, che qualora sia applicata deve essere indicata. Il tasso di recupero deve essere indicato a meno che la correzione intrinseca per distorsione faccia parte della procedura, ove la distorsione è la differenza tra il valore misurato e la concentrazione di riferimento. La correzione non è necessaria nel caso in cui il tasso di recupero sia compreso tra 90 e 110 %;

b) nella forma «x +/- U», dove x è il risultato dell'analisi (media di due determinazioni) e U l'incertezza di misura analitica estesa, calcolata per mezzo di un fattore di copertura 2 [3] corrispondente a un livello di fiducia del 95 % circa.

_____________

[1] Regolamento (UE) 2019/4 del Parlamento europeo e del Consiglio, dell'11 dicembre 2018, relativo alla fabbricazione, all'immissione sul mercato e all'utilizzo di mangimi medicati, che modifica il regolamento (CE) n. 183/2005 del Parlamento europeo e del Consiglio e che abroga la direttiva 90/167/CEE del Consiglio (GU L 4 del 7.1.2019).

[2] L'intervallo di confidenza del 95 % può essere raggiunto utilizzando un altro fattore come il fattore t.

[3] L'intervallo di confidenza del 95 % può essere raggiunto utilizzando un altro fattore come il fattore t.

(sostituito dall'allegato del Reg. (UE) n. 51/2013, modificato e integrato dall'allegato del Reg. (UE) 2020/1560 e modificato dall'art. 1 del Reg. (UE) 2022/893)

METODI D'ANALISI PER LA DETERMINAZIONE DEI COSTITUENTI DI ORIGINE ANIMALE NELL'AMBITO DEL CONTROLLO UFFICIALE DEGLI ALIMENTI PER ANIMALI

1. FINALITA' E CAMPO DI APPLICAZIONE

La determinazione dei costituenti di origine animale negli alimenti per animali deve essere eseguita mediante microscopia ottica o mediante reazione a catena della polimerasi (PCR) in conformità alle disposizioni del presente allegato.

Questi due metodi permettono di individuare la presenza di costituenti di origine animale nelle premiscele, nelle materie prime per mangimi e nei mangimi composti, ma non di calcolarne la quantità. Entrambi i metodi presentano un limite di rilevazione inferiore a 0,1 % (p/p).

Il metodo PCR consente di identificare il gruppo tassonomico dei costituenti di origine animale presenti nelle premiscele, nelle materie prime per mangimi e nei mangimi composti.

Questi metodi si applicano per il controllo dell'applicazione dei divieti di cui all'articolo 7, paragrafo 1, del regolamento (CE) n. 999/2001 del Parlamento europeo e del Consiglio (*), all'allegato IV di tale regolamento e all'articolo 11, paragrafo 1, del regolamento (CE) n. 1069/2009 del Parlamento europeo e del Consiglio (**).

In funzione del tipo di alimento per animali analizzato, questi metodi possono essere utilizzati, entro un unico protocollo operativo, singolarmente o in combinazione, secondo le procedure operative standard («POS») stabilite dal laboratorio di riferimento dell'UE per le proteine animali nei mangimi (EURL-AP) e pubblicate sul suo sito web (***).

2.1. Microscopia ottica

2.1.1. Principio

I costituenti di origine animale che possono essere presenti nelle premiscele, nelle materie prime per mangimi e nei mangimi composti sottoposti ad analisi sono individuati sulla base di caratteristiche tipiche e identificabili al microscopio, come fibre muscolari o altre particelle di carne, cartilagini, ossa, corna, peli, setole, frammenti cuticolari di invertebrati, strutture tracheali di insetti, prodotti sanguigni, globuli di latte, cristalli di lattosio, piume, gusci d'uovo, lische e scaglie.

Effettuare gli esami al microscopio dopo la preparazione di campioni mediante sedimentazione.

Sottoporre i campioni a una fase di sedimentazione come segue:

a) ai fini dell'individuazione dei costituenti di origine animale diversi dagli invertebrati terrestri, una fase di sedimentazione singola in tetracloroetilene (TCE) come precisato al punto 2.1.3.4.3;

b) ai fini dell'individuazione dei costituenti di invertebrati terrestri, una fase di sedimentazione doppia in etere di petrolio/tetracloroetilene (PE/TCE) come precisato al punto 2.1.3.4.4.

2.1.2. Reagenti e attrezzature

2.1.2.1. Reagenti

2.1.2.1.1. Agente concentratore

- Tetracloroetilene (peso specifico 1,62).

- Etere di petrolio (PE), con punto di ebollizione compreso tra 40 °C e 60 °C (peso specifico 0,65).

2.1.2.1.2. Reagente colorante

- Soluzione di rosso di alizarina (diluire 2,5 ml di acido cloridrico 1M in 100 ml di acqua, aggiungere 200 mg di rosso di alizarina alla soluzione).

2.1.2.1.3. Mezzi di montaggio

- Liscivia (NaOH a 2,5 % in p/v o KOH a 2,5 % in p/v).

- Glicerolo (non diluito, viscosità: 1 490 cP) o un mezzo di montaggio con proprietà equivalenti per la preparazione dei vetrini non permanenti.

- Norland ® Optical Adhesive 65 (viscosità: 1 200 cP) o resina con proprietà equivalenti per la preparazione dei vetrini permanenti.

2.1.2.1.4. Mezzi di montaggio con proprietà coloranti

- Soluzione di Lugol (sciogliere 2 g di ioduro di potassio in 100 ml di acqua e aggiungere 1 g di iodio agitando ripetutamente).

- Reagente cistina (2 g di acetato di piombo, 10 g di NaOH/100 ml di acqua).

- Reagente di Fehling (preparato prima dell'uso da parti eguali (1/1) di due soluzioni madre A e B: soluzione A (sciogliere 6,9 g di solfato di rame (II) pentaidrato in 100 ml di acqua); soluzione B (sciogliere 34,6 g di tartrato di potassio e di sodio tetraidrato e 12 g di NaOH in 100 ml di acqua).

- Tetrametilbenzidina/perossido di idrogeno (sciogliere 1 g di 3,3", 5,5" tetrametilbenzidina (TMB) in 100 ml di acido acetico glaciale e 150 ml di acqua. Prima dell'uso, mescolare 4 parti di questa soluzione di TMB con 1 parte di perossido di idrogeno al 3 %).

2.1.2.1.5. Agenti di risciacquo

- Etanolo ≥ 96 % (per analisi).

- Acetone (per analisi).

2.1.2.1.6. Reagente sbiancante

- Soluzione di ipoclorito di sodio in commercio (9-14 % di cloro attivo).

2.1.2.2. Attrezzature

- Bilancia analitica con precisione di 0,001 g.

- Apparecchiatura per macinazione: mulino a lame o a rotore. Se si utilizza un mulino a rotore, sono proibiti setacci a maglie ≤ 0,5 mm.

- Setacci a maglie quadrate di 0,25 mm e 1 mm di larghezza. Fatta eccezione per la presetacciatura del campione, il diametro dei setacci non deve superare i 10 cm per evitare la perdita di materiali. La taratura dei setacci non è necessaria.

- Imbuto separatore conico di vetro con capacità di 250 ml munito di rubinetto in teflon o vetro smerigliato alla base del cono. Il diametro dell'apertura del rubinetto deve essere di almeno ≥ 4 mm. In alternativa, unicamente per la sedimentazione singola in TCE, può essere utilizzato un decantatore a fondo conico, a condizione che il laboratorio abbia dimostrato che i livelli di rilevamento sono equivalenti a quelli ottenuti utilizzando l'imbuto separatore conico di vetro.

Imbuto separatore

- Stereomicroscopio con gamma di ingrandimenti finali almeno da 6,5x a 40x.

- Microscopio composto in campo chiaro a luce trasmessa con gamma di ingrandimenti finali almeno da 100x a 400x. Possono inoltre essere utilizzati la luce polarizzata e il contrasto interferenziale differenziale.

- Vetreria da laboratorio standard.

- Attrezzatura per la preparazione dei vetrini: vetrini per microscopio classici, vetrini concavi, vetrini coprioggetti (20x20 mm), pinzette, spatole

- Forno da laboratorio.

- Centrifuga.

- Carta da filtro: filtro in cellulosa per analisi qualitativa (dimensione dei pori: 4-11 μm).

2.1.3. Campionamento e preparazione del campione

2.1.3.1. Campionamento

Deve essere utilizzato un campione rappresentativo, prelevato secondo le prescrizioni di cui all'allegato I.

2.1.3.1.1. Essiccazione del campione

I campioni con tenore di umidità > 14 % devono essere essiccati prima del trattamento conformemente all'allegato III.

2.1.3.1.2. Presetacciatura del campione

Al fine di raccogliere informazioni su un'eventuale contaminazione ambientale del mangime, si raccomanda di presetacciare a 1 mm i mangimi pellettati e le granaglie e successivamente di preparare, analizzare ed esprimere separatamente le due frazioni risultanti, che devono essere considerate come campioni distinti.

2.1.3.2. Precauzioni

Per evitare rischi di contaminazione crociata in laboratorio, tutte le attrezzature riutilizzabili devono essere accuratamente pulite prima dell'uso. Prima di essere pulito l'imbuto separatore deve essere smontato. I pezzi che compongono l'imbuto separatore e la vetreria devono essere prima lavati a mano e poi in lavastoviglie. I setacci devono essere puliti usando una spazzola a setole sintetiche rigide. Dopo la setacciatura di materie grasse, come le farine di pesce, è raccomandata una pulitura finale dei setacci con acetone e aria compressa.

2.1.3.3. Preparazione di campioni costituiti da grassi o oli

Per la preparazione di campioni costituiti da grassi, seguire il seguente protocollo:

- se il grasso si presenta in forma solida, scaldarlo in un forno fino a liquefarlo.

- Utilizzando una pipetta, trasferire 40 ml di grasso dal fondo del campione in un tubo di centrifugazione.

- Centrifugare il campione per 10 min a 4 000 giri/minuto.

- Se il grasso si presenta in forma solida dopo la centrifugazione, riscaldarlo in un forno fino a liquefarlo.

- Ripetere la centrifugazione per 5 min a 4 000 giri/minuto.

- Utilizzando un cucchiaino o una spatola, trasferire metà delle impurità decantate su vetrini per microscopio per l'esame. Si raccomanda il glicerolo come mezzo di montaggio.

- Utilizzare le impurità restanti per preparare il sedimento come indicato al punto 2.1.3.4.3, primo trattino.

Applicare lo stesso protocollo, ad eccezione del primo e del quarto trattino, per la preparazione di campioni costituiti da oli.

2.1.3.4. Preparazione dei campioni diversi da grassi o oli

2.1.3.4.1. Sottocampionamento e macinatura: prelevare dal campione e macinare un sottocampione di almeno 50 g da analizzare.

2.1.3.4.2. Preparazione del campione tal quale: preparare un'aliquota di almeno 5 g di sottocampione macinato. Setacciarlo a 0,25 mm e procedere all'esame delle due frazioni risultanti.

2.1.3.4.3. Sedimentazione singola in TCE ai fini dell'individuazione dei costituenti di origine animale diversi dagli invertebrati terrestri.

- Estrazione e preparazione del sedimento:

trasferire un'aliquota di 10 g (precisione 0,01 g) del sottocampione macinato nell'imbuto separatore o nel decantatore a fondo conico e aggiungere 50 ml di TCE. L'aliquota trasferita nell'imbuto deve essere limitata a 3 g nel caso delle farine di pesce o di altri prodotti di origine esclusivamente animale, di ingredienti minerali o di premiscele che generano più del 10 % di sedimento. Agitare vigorosamente la miscela per almeno 30 secondi e versare con cautela altri 50 ml di TCE sulla superficie interna dell'imbuto per rimuovere le particelle ad esso aderenti. Lasciare riposare la miscela così ottenuta per almeno 5 minuti prima di separare il sedimento aprendo il rubinetto.

Se è utilizzato un decantatore a fondo conico, agitare vigorosamente la miscela per almeno 15 secondi e lavare accuratamente la superficie interna del decantatore con almeno 10 ml di TCE pulito per rimuovere le particelle aderenti alle pareti. Lasciare riposare la miscela per 3 minuti, quindi agitare nuovamente per 15 secondi e lavare accuratamente la superficie interna del decantatore con almeno 10 ml di TCE pulito per rimuovere le particelle aderenti alle pareti. Lasciare riposare la miscela così ottenuta per almeno 5 minuti, quindi rimuovere ed eliminare la frazione liquida travasandola accuratamente, facendo attenzione a non perdere nulla del sedimento.

Il sedimento deve essere raccolto su una carta da filtro posizionata in un imbuto per consentire la separazione del TCE rimanente, evitando al contempo la deposizione di grasso nel sedimento. Il sedimento deve essere lasciato essiccare. Si raccomanda di pesare successivamente il sedimento (con una precisione di 0,001 g) per controllare la fase di sedimentazione. Infine setacciare il sedimento a 0,25 mm e procedere all'esame delle due frazioni risultanti, a meno che la setacciatura non sia ritenuta necessaria.

- Estrazione e preparazione del flottato:

dopo il recupero del sedimento con il metodo sopra descritto, devono rimanere nell'imbuto separatore due fasi: una fase liquida costituita dal TCE e una fase solida costituita dal materiale flottante. Recuperare la fase solida (flottato) facendo defluire completamente dall'imbuto il TCE aprendo il rubinetto. Rovesciando l'imbuto separatore, trasferire il flottato in una grande piastra Petri e farlo essiccare ad aria in una cappa aspirante. Setacciarlo a 0,25 mm e procedere all'esame delle due frazioni risultanti.

- Uso di reagenti coloranti

Per facilitare la corretta identificazione dei costituenti di origine animale, l'operatore può utilizzare reagenti di colorazione durante la preparazione dei campioni, seguendo le linee guida emesse dall'EURL-AP e pubblicate sul suo sito web.

Il sedimento può essere sottoposto a colorazione utilizzando una soluzione di rosso di alizarina, applicando il seguente protocollo:

- trasferire il sedimento secco in una provetta di vetro e risciacquare due volte con circa 5 ml di etanolo (utilizzare ogni volta un agitatore Vortex per 30 secondi, lasciare decantare il solvente per circa 1 minuto e 30 secondi ed eliminarlo).

- Sbiancare il sedimento aggiungendo almeno 1 ml di soluzione di ipoclorito di sodio. Lasciare reagire per 10 minuti. Riempire d'acqua la provetta, lasciare decantare il sedimento per 2-3 minuti ed eliminare con cautela l'acqua e le particelle in sospensione.

- Risciacquare altre due volte il sedimento con circa 10 ml di acqua (utilizzare un agitatore Vortex per 30 secondi, lasciare decantare ed eliminare l'acqua ogni volta).

- Aggiungere da 2 a 10 gocce di soluzione di rosso di alizarina e agitare nel Vortex la miscela. Lasciare reagire per 30 secondi e risciacquare due volte il sedimento colorato con circa 5 ml di etanolo e poi una volta con acetone (utilizzare ogni volta un agitatore Vortex per 30 secondi, lasciare decantare il solvente per circa 1 minuto ed eliminarlo).

- Essiccare il sedimento colorato.

2.1.3.4.4. Sedimentazione doppia in PE/TCE ai fini dell'individuazione dei costituenti di invertebrati terrestri.

Tutte le fasi devono essere effettuate in un imbuto separatore conico di vetro da 250 ml, come descritto al punto 2.1.2.2, quarto trattino.

- Trasferire un'aliquota di 10 g (precisione 0,01 g) del sottocampione macinato nell'imbuto separatore e sottoporla dapprima a una sedimentazione singola in TCE, come descritto al punto 2.1.3.4.3, compreso il recupero del sedimento su una carta da filtro posizionata su un imbuto. Questo sedimento può essere utilizzato come quello ottenuto come descritto al punto 2.1.3.4.3.

- Trasferire in un cilindro graduato il piccolo volume di TCE fatto colare con il sedimento. Il cilindro graduato deve essere ulteriormente riempito, aprendo il rubinetto dell'imbuto separatore, fino a ottenere 30 ml di TCE. Una volta raggiunto questo volume, chiudere il rubinetto.

- Sostituire il volume raccolto di TCE aggiungendo nell'imbuto separatore un volume di 30 ml di etere di petrolio, con punto di ebollizione compreso tra 40 °C e 60 °C. Mescolare accuratamente il contenuto dell'imbuto separatore per ottenere una miscela costituita da 30 % PE/70 % TCE (con una densità di circa 1,26 g/cm-3). Lasciare riposare il materiale per 10 minuti. Si separeranno due nuove frazioni: un secondo sedimento e un flottato finale (< 1,26 g/cm-3). Recuperare il secondo sedimento in una piastra Petri (o su una carta da filtro posizionata su un imbuto) aprendo il rubinetto fino a quando nell'imbuto di separazione restano solo una piccola quantità di miscela solvente e il flottato finale. Raccogliere separatamente su una carta da filtro posizionata su un imbuto il liquido residuo e il flottato finale. Risciacquare la parete dell'imbuto di separazione con un getto di PE per raccogliere tutto il materiale dal flottato finale. Lasciare essiccare il flottato finale. Setacciare il flottato finale a 0,25 mm, a meno che la setacciatura non sia ritenuta necessaria, e procedere all'esame delle due frazioni risultanti ai fini dell'individuazione dei costituenti di invertebrati terresti.

2.1.4. Esame al microscopio

2.1.4.1. Preparazione dei vetrini

Preparare i vetrini per microscopio a partire dal sedimento e, a scelta dell'operatore, dal flottato o dal campione tal quale. Se del caso, unicamente ai fini dell'individuazione dei costituenti di invertebrati terrestri, preparare i vetrini anche a partire dal flottato finale ottenuto come descritto al punto 2.1.3.4.4. Preparare le due frazioni risultanti (fine e grossolana). Le aliquote sottoposte ad analisi delle frazioni distribuite sui vetrini devono essere rappresentative dell'intera frazione.

Preparare un numero di vetrini sufficiente affinché possa essere realizzato un protocollo d'esame completo, come previsto al punto 2.1.4.2.

Montare i vetrini per microscopio con il mezzo di montaggio adeguato secondo le procedure operative standard (POS) stabilite dall'EURL-AP e pubblicate sul suo sito web. Posizionare sui vetrini portaoggetti i vetrini coprioggetti.

2.1.4.2. Diagramma di flusso per l'osservazione ai fini dell'individuazione di particelle animali nei mangimi composti, nelle materie prime per mangimi e nelle premiscele

Per l'osservazione dei vetrini per microscopio preparati procedere conformemente ai diagrammi di flusso di cui ai diagrammi 1 e 2.

Le osservazioni microscopiche devono essere effettuate utilizzando il microscopio composto sul sedimento e, a scelta dell'operatore, sul flottato o sul campione tal quale. Inoltre, ai fini dell'individuazione dei costituenti di invertebrati terrestri, deve essere sottoposto a osservazione anche il flottato finale ottenuto come descritto al punto 2.1.3.4.4 conformemente al diagramma 3. Lo stereomicroscopio può essere utilizzato in aggiunta al microscopio composto per l'osservazione delle frazioni grossolane. Ogni vetrino deve essere esaminato interamente a vari ingrandimenti. Precisazioni in merito all'utilizzo dei diagrammi di flusso sono fornite mediante una POS stabilita dall'EURL-AP e pubblicata sul suo sito web.

Il numero minimo di vetrini da osservare in ogni fase dei diagrammi di flusso per l'osservazione deve essere rigorosamente rispettato, a meno che sia impossibile, pur utilizzando tutto il materiale della frazione, raggiungere il numero di vetrini stabilito, ad esempio se non si ottiene alcun sedimento. Al fine di registrare il numero di particelle, per ogni determinazione devono essere osservati non più di 6 vetrini.

Se si preparano vetrini aggiuntivi a partire dal flottato o dal campione tal quale utilizzando un mezzo di montaggio più specifico con proprietà coloranti, come indicato al punto 2.1.2.1.4, per caratterizzare ulteriormente le strutture (ad esempio piume, peli, muscolo o particelle di sangue) individuate sui vetrini preparati con altri mezzi di montaggio, come indicato al punto 2.1.2.1.3, il numero di particelle deve essere conteggiato in base a un numero di vetrini per determinazione non superiore a 6, compresi i vetrini aggiuntivi per i quali è stato utilizzato un mezzo di montaggio più specifico. I vetrini aggiuntivi, preparati a partire dal flottato finale ottenuto come descritto al punto 2.1.3.4.4, ai fini dell'individuazione dei costituenti di invertebrati terrestri non devono essere presi in considerazione per l'individuazione di elementi di nature diverse (vertebrati terrestri e pesci).

Per facilitare l'identificazione della natura e dell'origine delle particelle, l'operatore può utilizzare ausili quali sistemi di aiuto alle decisioni, gallerie di immagini e campioni di riferimento.

Diagramma 1

Diagramma di flusso per l'osservazione dopo la sedimentazione singola in TCE ai fini dell'individuazione di particelle animali diverse dagli invertebrati terrestri nei mangimi composti, nelle materie prime per mangimi e nelle premiscele per la prima determinazione

Diagramma 2

Diagramma di flusso per l'osservazione dopo la sedimentazione singola in TCE ai fini dell'individuazione di particelle animali diverse dagli invertebrati terrestri nei mangimi composti, nelle materie prime per mangimi e nelle premiscele per la seconda determinazione

Diagramma 3

Diagramma di flusso per l'osservazione dopo la sedimentazione doppia in PE/TCE ai fini dell'individuazione dei costituenti di invertebrati terrestri nei mangimi composti, nelle materie prime per mangimi e nelle premiscele

2.1.4.3. Numero di determinazioni

Le determinazioni devono essere effettuate su sottocampioni diversi, ognuno di 50 g.

Se, a seguito della prima determinazione effettuata secondo il diagramma di flusso per l'osservazione figurante nel diagramma 1, o se del caso nel diagramma 3, non sono individuate particelle animali, non è necessaria una determinazione aggiuntiva e il risultato dell'analisi è espresso utilizzando la frase di cui al punto 2.1.5.1.

Se, a seguito della prima determinazione effettuata secondo il diagramma di flusso per l'osservazione figurante nel diagramma 1, sono individuate una o più particelle animali di una data natura (ossia vertebrati terrestri o pesci) e la natura delle particelle individuate conferma il contenuto dichiarato del campione, non è necessaria una seconda determinazione. Se il numero delle particelle animali di una data natura individuate durante tale prima determinazione è superiore a 5, il risultato dell'analisi deve essere espresso in base alla natura animale utilizzando la frase di cui al punto 2.1.5.3. In caso contrario, il risultato dell'analisi deve essere espresso in base alla natura animale utilizzando la frase di cui al punto 2.1.5.2.

Se, a seguito della prima determinazione effettuata secondo il diagramma di flusso per l'osservazione figurante nel diagramma 3, sono individuate più di 5 particelle di invertebrati terrestri, non è necessaria una seconda determinazione e il risultato dell'analisi deve essere espresso utilizzando la frase di cui al punto 2.1.5.3 per tale natura.

In tutti gli altri casi, compreso il caso in cui non è stata fornita al laboratorio alcuna dichiarazione del contenuto, effettuare una seconda determinazione a partire da un nuovo sottocampione. Se, a seguito della seconda determinazione effettuata secondo il diagramma di flusso per l'osservazione figurante nel diagramma 2, o se del caso nel diagramma 3, la somma delle particelle animali di una data natura individuate nelle due determinazioni è superiore a 10, il risultato dell'analisi deve essere espresso in base alla natura animale utilizzando la frase di cui al punto 2.1.5.3. In caso contrario, il risultato dell'analisi deve essere espresso in base alla natura animale utilizzando la frase di cui al punto 2.1.5.2.

2.1.5. Espressione dei risultati

Quando comunica i risultati, il laboratorio deve indicare il tipo di materiale su cui è stata effettuata l'analisi (sedimento, flottato, flottato finale o campione tal quale). Il rapporto deve indicare chiaramente quante determinazioni sono state effettuate e se non è stata eseguita la setacciatura delle frazioni prima della preparazione dei vetrini, in conformità al punto 2.1.3.4.3, primo trattino, terzo capoverso, o al punto 2.1.3.4.4, terzo trattino.

Il rapporto del laboratorio deve contenere almeno informazioni sulla presenza di costituenti derivati da vertebrati terrestri e da pesci.

Le diverse situazioni devono essere riportate nei modi sottoindicati.

2.1.5.1. Non sono state individuate particelle animali di una data natura:

- «Nel campione esaminato al microscopio ottico non sono state individuate particelle derivate da vertebrati terrestri.»

- «Nel campione esaminato al microscopio ottico non sono state individuate particelle derivate da pesci.».

- «Nel campione esaminato al microscopio ottico non sono state individuate particelle derivate da invertebrati terrestri.»

2.1.5.2. Se sono individuate tra 1 e 5 particelle animali di una data natura, nel caso in cui sia stata effettuata una sola determinazione, oppure se sono state individuate tra 1 e 10 particelle di una data natura, nel caso in cui siano state effettuate due determinazioni (il numero di particelle individuate è inferiore al limite di decisione stabilito nelle POS dell'EURL-AP e pubblicate sul suo sito web):

se è stata effettuata una sola determinazione:

- «Nel campione esaminato al microscopio ottico sono state individuate non più di 5 particelle derivate da vertebrati terrestri. Le particelle sono state identificate come ... [ossa, cartilagine, muscolo, peli, corna, altro (specificare a seconda del caso)]. Questo basso numero di particelle è inferiore al limite di decisione stabilito per questo metodo microscopico.»

- «Nel campione esaminato al microscopio ottico sono state individuate non più di 5 particelle derivate da pesci. Le particelle sono state identificate come ... [lisca, scaglia, cartilagine, muscolo, otolite, branchia, altro (specificare a seconda del caso)]. Questo basso numero di particelle è inferiore al limite di decisione stabilito per questo metodo microscopico.»

Se sono state effettuate due determinazioni:

- «Nel campione esaminato al microscopio ottico sono state individuate non più di 10 particelle derivate da vertebrati terrestri nelle due determinazioni. Le particelle sono state identificate come ... [ossa, cartilagine, muscolo, peli, corna, altro (specificare a seconda del caso)]. Questo basso numero di particelle è inferiore al limite di decisione stabilito per questo metodo microscopico.»

- «Nel campione esaminato al microscopio ottico sono state individuate non più di 10 particelle derivate da pesci nel corso delle due determinazioni. Le particelle sono state identificate come ... [lisca, scaglia, cartilagine, muscolo, otolite, branchia, altro (specificare a seconda del caso)]. Questo basso numero di particelle è inferiore al limite di decisione stabilito per questo metodo microscopico.»

- «Nel campione esaminato al microscopio ottico sono state individuate non più di 10 particelle derivate da invertebrati terrestri nel corso delle due determinazioni. Le particelle sono state identificate come... [frammenti di cuticole, parti di bocca, muscoli, strutture tracheali, altro (specificare se del caso)]. Questo basso numero di particelle è inferiore al limite di decisione stabilito per questo metodo microscopico.»

Inoltre:

- se il campione è stato sottoposto a presetacciatura, il rapporto del laboratorio deve indicare in quale frazione (frazione setacciata, frazione pellettata o granuli) sono state individuate le particelle animali, in quanto l'individuazione di particelle animali soltanto nella frazione setacciata può essere il segno di una contaminazione ambientale.

- Se sono individuate solo particelle animali che non possono essere classificate come vertebrati terrestri o pesci (ad esempio fibre muscolari), il rapporto deve indicare che sono state individuate solo tali particelle animali e che non si può escludere la loro provenienza da vertebrati terrestri.

2.1.5.3. Se sono individuate più di 5 particelle animali di una data natura, nel caso in cui sia stata effettuata una sola determinazione, o più di 10 particelle di una data natura, nel caso di due determinazioni:

se è stata effettuata una sola determinazione:

- «Nel campione esaminato al microscopio ottico sono state individuate più di 5 particelle derivate da vertebrati terrestri. Le particelle sono state identificate come ... [ossa, cartilagine, muscolo, peli, corna, altro (specificare a seconda del caso)].»

- «Nel campione esaminato al microscopio ottico sono state individuate più di 5 particelle derivate da pesci. Le particelle sono state identificate come ... [lisca, scaglia, cartilagine, muscolo, otolite, branchia, altro (specificare a seconda del caso)].»

- «Nel campione esaminato al microscopio ottico sono state individuate più di 5 particelle derivate da invertebrati terrestri. Le particelle sono state identificate come... [frammenti di cuticole, parti di bocca, muscoli, strutture tracheali, altro (specificare a seconda del caso)].»

Se sono state effettuate due determinazioni:

- «Nel campione esaminato al microscopio ottico sono state individuate più di 10 particelle derivate da vertebrati terrestri nel corso delle due determinazioni. Le particelle sono state identificate come ... [ossa, cartilagine, muscolo, peli, corna, altro (specificare a seconda del caso)].»

- «Nel campione esaminato al microscopio ottico sono state individuate più di 10 particelle derivate da pesci nel corso delle due determinazioni. Le particelle sono state identificate come ... [lisca, scaglia, cartilagine, muscolo, otolite, branchia, altro (specificare a seconda del caso)].»

- «Nel campione esaminato al microscopio ottico sono state individuate più di 10 particelle derivate da invertebrati terrestri nel corso delle due determinazioni. Le particelle sono state identificate come... [frammenti di cuticole, parti di bocca, muscoli, strutture tracheali, altro (specificare a seconda del caso)].»

Inoltre:

- se il campione è stato sottoposto a presetacciatura, il rapporto del laboratorio deve indicare in quale frazione (frazione setacciata, frazione pellettata o granuli) sono state individuate le particelle animali, in quanto l'individuazione di particelle animali soltanto nella frazione setacciata può essere il segno di una contaminazione ambientale.

- Se sono individuate solo particelle animali che non possono essere classificate come vertebrati terrestri o pesci (ad esempio fibre muscolari), il rapporto deve indicare che sono state individuate solo tali particelle animali e che non si può escludere la loro provenienza da vertebrati terrestri.

2.2. Reazione a catena della polimerasi (PCR)

2.2.1. Principio

I frammenti di acido desossiribonucleico (DNA) di origine animale che possono essere presenti nelle materie prime per mangimi e nei mangimi composti sono individuati con una tecnica di amplificazione genica mediante la PCR, mirata a sequenze di DNA specifiche delle specie.

Il metodo PCR richiede dapprima una fase di estrazione del DNA. All'estratto di DNA così ottenuto è quindi applicata la fase di amplificazione per individuare la specie animale bersaglio.

2.2.2. Reagenti e attrezzature

2.2.2.1. Reagenti

2.2.2.1.1. Reagenti per l'estrazione del DNA

Utilizzare solo i reagenti approvati dall'EURL-AP e pubblicati sul suo sito web.

2.2.2.1.2. Reagenti per l'amplificazione genica

2.2.2.1.2.1. Primer e sonde Utilizzare solo primer e sonde con sequenze oligonucleotidiche validate dall'EURL-AP (2).

2.2.2.1.2.2. Master Mix

Utilizzare solo soluzioni Master Mix che non contengono reagenti che possono portare a risultati falsi a causa della presenza di DNA animale (3).

2.2.2.1.2.3. Reagenti di decontaminazione

2.2.2.1.2.3.1. Soluzione di acido cloridrico (0,1N)

2.2.2.1.2.3.2. Candeggina (soluzione di ipoclorito di sodio allo 0,15% di cloro attivo)

2.2.2.1.2.3.3. Reagenti non corrosivi per la decontaminazione di dispositivi costosi come le bilance analitiche (ad esempio DNA Erase TM di MP Biomedicals)

2.2.2.2. Attrezzature

2.2.2.2.1. Bilancia analitica con precisione di 0,001 g

2.2.2.2.2. Apparecchiatura di macinazione

2.2.2.2.3. Termociclatore per PCR real-time

2.2.2.2.4. Microcentrifuga per microprovette

2.2.2.2.5. Set di micropipette per prelievi da 1 ml a 1 000 ml

2.2.2.2.6. Plastiche standard per biologia molecolare: microprovette per microcentrifuga, puntali con filtro per micropipette, piastre adatte al termociclatore

2.2.2.2.7. Congelatori per la conservazione dei campioni e dei reagenti

2.2.3. Campionamento e preparazione del campione

2.2.3.1. Campionamento

Deve essere utilizzato un campione rappresentativo, prelevato secondo le prescrizioni dell'allegato I.

2.2.3.2. Preparazione del campione

La preparazione dei campioni di laboratorio fino all'estrazione del DNA deve avvenire secondo le prescrizioni dell'allegato II. Dal campione è prelevato e successivamente macinato un sottocampione di almeno 50 g da analizzare.

La preparazione del campione deve essere effettuata in un locale diverso da quelli utilizzati per l'estrazione del DNA e per le reazioni di amplificazione genica, come descritto dalla norma ISO 24276.

Preparare due aliquote del campione in analisi, ciascuna di peso non inferiore a 100 mg.

2.2.4. Estrazione del DNA

L'estrazione del DNA è effettuata su ogni aliquota da saggio preparata utilizzando le POS stabilite dall'EURL- AP e pubblicate sul suo sito web.

Per ciascuna serie di estrazioni sono preparati due controlli di estrazione, come descritto dalla norma ISO 24276:

- un controllo di estrazione in bianco,

- un controllo di estrazione del DNA positivo.

2.2.5. Amplificazione genica

L'amplificazione genica è effettuata utilizzando i metodi convalidati per ciascuna specie da identificare, indicati nelle POS stabilite dall'EURL-AP e pubblicate sul suo sito web. Ogni estratto di DNA è analizzato almeno a due diverse diluizioni per valutare l'inibizione.

Per ogni specie bersaglio sono preparati due controlli di amplificazione, come descritto dalla norma ISO 24276:

- per ciascuna piastra o serie di saggi PCR è utilizzato un controllo positivo del DNA bersaglio,

- per ciascuna piastra o serie di saggi PCR è utilizzato un controllo di amplificazione dei soli reagenti (controllo "no template").

2.2.6. Interpretazione ed espressione dei risultati

Quando comunica i risultati, il laboratorio indica almeno il peso delle aliquote sottoposte ad analisi, la tecnica di estrazione utilizzata, il numero delle determinazioni eseguite e il limite di rilevazione del metodo.

I risultati non devono essere interpretati e comunicati se il controllo positivo dell'estrazione del DNA e i controlli positivi del DNA bersaglio non forniscono risultati positivi per il bersaglio analizzato, mentre il controllo di amplificazione dei soli reagenti è negativo.

Se i risultati delle due aliquote del campione analizzato non sono coerenti, è ripetuto almeno lo step dell'amplificazione genica. Se il laboratorio sospetta che gli estratti di DNA possano essere la causa dell'incoerenza, sono effettuate una nuova estrazione del DNA e una successiva amplificazione genica prima di interpretare i risultati.

L'espressione finale dei risultati si basa sull'integrazione e sull'interpretazione dei risultati delle due aliquote analizzate secondo le POS stabilite dall'EURL-AP e pubblicate sul suo sito web.

2.2.6.1. Risultato negativo

Un risultato negativo è espresso come segue:

Nel campione esaminato non è stato individuato DNA di X (X è la specie animale o il gruppo di specie animali bersaglio).

2.2.6.2. Risultato positivo

Un risultato positivo è espresso come segue:

Nel campione esaminato è stato individuato DNA di X (X è la specie animale o il gruppo di specie animali bersaglio).

_____________

(*) Regolamento (CE) n. 999/2001 del Parlamento europeo e del Consiglio, del 22 maggio 2001, recante disposizioni per la prevenzione, il controllo e l'eradicazione di alcune encefalopatie spongiformi trasmissibili (GU L 147 del 31.5.2001)."

(**) Regolamento (CE) n. 1069/2009 del Parlamento europeo e del Consiglio, del 21 ottobre 2009, recante norme sanitarie relative ai sottoprodotti di origine animale e ai prodotti derivati non destinati al consumo umano e che abroga il regolamento (CE) n. 1774/2002 (regolamento sui sottoprodotti di origine animale) (GU L 300 del 14.11.2009)."

(***) https://www.eurl.craw.eu/legal-sources-and-sops/method-of-reference-and-sops/

(2) L'elenco dei primer e delle sonde per ciascuna specie animale bersaglio è disponibile sul sito web dell'EURL-AP.

(3) Esempi di Master Mix funzionali sono disponibili sul sito web dell'EURL-AP.

(sostituito dall'art. 1 del Reg. (UE) 2024/771)

METODO DI CALCOLO DEL VALORE ENERGETICO DEGLI ALIMENTI DESTINATI AL POLLAME

1. METODO DI CALCOLO ED ESPRESSIONE DEL VALORE ENERGETICO

Il valore energetico degli alimenti composti destinati al pollame deve essere calcolato secondo la formula che segue, in base alle percentuali di alcuni componenti analitici degli alimenti; il valore è espresso in megajoule (MJ) di energia metabolizzabile (ME), corretta in azoto, per chilogrammo di alimento composto:

MJ/kg di ME = 0,1551 × % proteine gregge + 0,3431 × % grassi greggi + 0,1669 × % amido + 0,1301 × % zuccheri totali (espressi in saccarosio).

2. TOLLERANZE APPLICABILI AI VALORI DICHIARATI

Se, a seguito dei controlli ufficiali si constata una differenza (in più o in meno) fra il risultato del controllo del valore energetico dell'alimento e il valore energetico dichiarato, è applicata una tolleranza di 0,4 MJ/kg di ME.

3. ESPRESSIONE DEI RISULTATI

Previa applicazione della formula suindicata, il risultato ottenuto è approssimato al primo decimale.

4. MODALITA' DI PRELIEVO DEI CAMPIONI E METODI DI ANALISI

Il prelievo del campione dell'alimento composto e la determinazione dei tenori dei componenti analitici indicati nel metodo di calcolo devono essere effettuati rispettivamente secondo i metodi di campionamento e i metodi di analisi dell'Unione per il controllo ufficiale degli alimenti per animali.

Vanno applicati:

- per la determinazione dei grassi greggi: la procedura B del metodo per la determinazione degli oli e dei grassi greggi, di cui all'allegato III, parte G;

- per la determinazione dell'amido: il metodo polarimetrico, di cui all'allegato III, parte K.

METODO DI CALCOLO DEL VALORE ENERGETICO DELLE MATERIE PRIME PER MANGIMI E DEI MANGIMI COMPOSTI PER GATTI E CANI

Il valore energetico delle materie prime per mangimi e dei mangimi composti per gatti e cani deve essere calcolato conformemente alla norma EN 16967 Alimenti per animali: Metodi per campionamento e analisi - Equazioni predittive per l'energia metabolizzabile nei materiali per mangimi e mangimi composti (alimenti per animali da compagnia) per gatti e cani compresi i prodotti alimentari dietetici.

(soppresso dall'art. 1 del Reg. (UE) 2024/771)

[METODI DI ANALISI PER IL CONTROLLO DELLA PRESENZA ILLECITA NEGLI ALIMENTI PER ANIMALI DI ADDITIVI NON PIU' AUTORIZZATI

Osservazioni importanti:

Possono essere applicati metodi di analisi più sensibili di quelli citati nel presente allegato per individuare la presenza illecita di additivi il cui uso negli alimenti per animali non è più autorizzato.

I metodi di analisi citati nel presente allegato sono utilizzati a fini di conferma.

A. DETERMINAZIONE DEL METILBENZOQUATO

(7-benzilossi-6-butil-3-metossicarbonil-4-chinolone)

1. Finalità e campo d'applicazione

Il metodo consente di determinare il contenuto di metilbenzoquato negli alimenti per animali. Il limite di quantificazione è di 1 mg/kg.

2. Principio

Il metilbenzoquato viene estratto dal campione con una soluzione metanolica di acido metansolfonico. L'estratto è purificato con diclorometano, mediante cromatografia a scambio ionico e poi nuovamente con diclorometano. Il tenore del metilbenzoquato è determinato mediante cromatografia liquida ad alta prestazione (HPLC) in fase inversa utilizzando un rivelatore UV.

3. Reattivi

3.1. Diclorometano

3.2. Metanolo, di qualità HPLC

3.3. Fase mobile per HPLC

miscela di metanolo (3.2) e acqua (di qualità HPLC) 75 + 25 (v + v).

Filtrare la soluzione attraverso un filtro di 0,22 m m (4.5) e degassarla (ad esempio sottoponendola per 10 minuti a trattamento con ultrasuoni).

3.4. Soluzione di acido metansolfonico, c = 2%

Diluire 20,0 ml di acido metansolfonico e portarlo a 1.000 ml con metanolo (3.2).

3.5. Soluzione di acido cloridrico, c = 10%.

Prelevare 100 ml d'acido cloridrico (r ₂₀ 1,18 g/ml) e portare a 1.000 ml con acqua.

3.6. Resina scambiatrice di cationi Amberlite CG-120 (Na), 100-200 mesh

La resina viene pretrattata prima dell'uso. Sospendere 100 g di resina con 500 ml di soluzione di acido cloridrico (3.5) e portare ad ebollizione su piastra calda continuando ad agitare. Lasciare raffreddare e decantare l'acido. Filtrare attraverso carta da filtro sotto vuoto. Lavare due volte la resina con 500 ml di acqua e poi con 250 ml di metanolo (3.2). Risciacquare una seconda volta la resina con 250 ml di metanolo ed essiccarla insufflando aria attraverso il panello del filtro. Conservare la resina essiccata in una bottiglia chiusa con tappo.

3.7. Sostanza di riferimento (standard): metilbenzoquato puro (7-benzilossi-6-butil-3-metossicarbonil-4-chinolone).

3.7.1. S o l u z i o n e madre s t a n d a r d d i m e t i l b e n z o q u a t o, 500 m g / ml

Pesare, con l'approssimazione di 0,1 mg, 50 mg di sostanza standard (3.7), scioglierli in soluzione di acido

metansolfonico (3.4) in un pallone tarato da 100 ml, portare a volume e miscelare.

3.7.2. Soluzione standard intermedia di metilbenzoquato, 50 m g / m l

Trasferire 5,0 ml della soluzione madre standard di metilbenzoquato (3.7.1) in un pallone tarato da 50 ml, portare a volume con metanolo (3.2) e miscelare.

3.7.3. Soluzioni di taratura

In una serie di palloni tarati da 25 ml, trasferire 1,0, 2,0, 3,0, 4,0 e 5,0 ml della soluzione standard intermedia di metilbenzoquato (3.7.2). Portare a volume con la fase mobile (3.3) e miscelare. Queste soluzioni presentano rispettivamente concentrazioni di 2,0, 4,0, 6,0, 8,0 e 10,0 m g/ml di metilbenzoquato. Esse devono essere preparate al momento, poco prima dell'uso.

4. Apparecchiatura

4.1. Agitatore da laboratorio

4.2. Evaporatore rotante a film

4.3. Colonna di vetro (250 mm x 15 mm) dotata di rubinetto e serbatoio della capacità di circa 200 ml

4.4. Apparecchiatura HPLC a rivelatore UV, a lunghezza d'onda variabile, oppure rivelatore a serie di diodi.

4.4.1. Colonna per cromatografia liquida: 300 mm x 4 mm, C18, particelle di riempimento 10 m m, o equivalente

4.5. Filtri a membrana, da 0,22 m m.

4.6. Filtri a membrana, da 0,45 m m.

5. Procedimento

5.1. Indicazioni generali

5.1.1. Analizzare un campione di alimento bianco, per accertare l'assenza del metilbenzoquato o di altre sostanze che possono interferire.

5.1.2. Procedere a una prova di recupero, analizzando un campione in bianco dell'alimento addizionato con una quantità di metilbenzoquato simile a quella presente nel campione. Per ottenere una concentrazione di 15 mg/kg, aggiungere 600 m l della soluzione madre standard (3.6.1) a 20 g dell'alimento bianco, mescolare e attendere 10 minuti prima di procedere all'estrazione (5.2).

Nota: Ai fini del presente metodo, l'alimento bianco ha una composizione simile a quella del campione e all'analisi il metilbenzoquato non deve risultare presente.

5.2. Estrazione

Pesare, con l'approssimazione di 0,01 g, circa 20 g del campione preparato e trasferirli in una beuta da 250 ml.

Aggiungere 100,0 ml di soluzione di acido metansolfonico (3.4) e agitare in agitatore meccanico (4.1) per 30 minuti. Filtrare la soluzione attraverso carta da filtro e conservare il filtrato per la fase di separazione liquidoliquido (5.3).

5.3. Separazione liquido-liquido

In un imbuto separatore da 500 ml contenente 100 ml di soluzione di acido cloridrico (3.5), trasferire 25,0 ml del filtrato ottenuto come descritto al punto (5.2). Introdurre nell'imbuto 100 ml di diclorometano (3.1) e agitare per 1 minuto. Lasciare separare gli strati e versare lo strato inferiore (diclorometano) in un pallone da 500 ml. Ripetere l'estrazione della fase acquosa con altri due volumi di 40 ml di diclorometano e riunirli con il primo estratto nel pallone a fondo arrotondato. Evaporare a secchezza nell'evaporatore rotante (4.2) l'estratto di diclorometano a 40°C a pressione ridotta. Sciogliere il residuo in 20-25 ml di metanolo (3.2), tappare il pallone e conservare tutto l'estratto per la cromatografia a scambio ionico (5.4).

5.4. Cromatografia a scambio ionico

5.4.1. Preparazione della colonna a scambio cationico

Inserire un tappo di lana di vetro nell'estremità inferiore di una colonna di vetro (4.3). Preparare una sospensione di 5,0 g della resina a scambio cationico trattata (3.6) con 50 ml di acido cloridrico (3.5), versare nella colonna di vetro e far decantare. Scaricare l'eccesso di acido fino a poco sopra la superficie della resina e lavare la colonna con acqua fino a quando l'effluente è neutro al tornasole. Trasferire 50 ml di metanolo (3.2) nella colonna e drenare fino alla superficie della resina.

5.4.2. Cromatografia su colonna

Mediante una pipetta, trasferire accuratamente l'estratto ottenuto come descritto al punto 5.3 nella colonna.

Risciacquare il pallone con due volumi di 5-10 ml di metanolo (3.2) e trasferire questi liquidi di lavaggio nella colonna. Scaricare l'estratto fino alla superficie della resina e lavare la colonna con 50 ml di metanolo facendo attenzione che lai defluiscano ad una velocità pari o inferiore a 5 ml al minuto. Eliminare tutto il filtrato. Eluire il metilbenzoquato dalla colonna utilizzando 150 ml di soluzione di acico metansolfonico (3.4) e raccogliere l'eluato della colonna in una beuta da 250 ml.

5.5. Separazione liquido-liquido

Trasferire l'eluato ottenuto come descritto al punto 5.4.2 in un imbuto separatore da 1 litro. Risciacquare la beuta con 5-10 ml di metanolo (3.2) e aggiungere il liquido di risciacquo al contenuto dell'imbuto separatore. Aggiungere 300 ml di soluzione di acido cloridrico (3.5) e 130 ml di diclorometano (3.1). Agitare per 1 minuto e lasciar separare le fasi. Versare lo strato inferiore (diclorometano) in un matraccio a fondo arrotondato da 500 ml. Ripetere l'estrazione della fase acquosa con altri due volumi di 70 ml di diclorometano e aggiungere questi estratti al primo nel matraccio.

In evaporatore rotante evaporare a secchezza (4.2) l'estratto di diclorometano a 40 oC a pressione ridotta. Sciogliere il residuo contenuto nel pallone con circa 5 ml di metanolo (3.2) e trasferire quantitativamente questa soluzione in un matraccio tarato da 10 ml. Risciacquare il pallone con altri due volumi di 1-2 ml di metanolo e trasferire anche questi nel matraccio tarato. Portare a volume con il metanolo e miscelare. Un'aliquota viene filtrata attraverso un filtro a membrana (4.6). Conservare questa soluzione per la determinazione mediante HPLC (5.6).

5.6. Determinazione HPLC

5.6.1. Parametri

I parametri seguenti sono proposti a titolo indicativo; è possibile operare in condizioni diverse, purché si ottengano risultati equivalenti:

- Colonna per cromatografia liquida (4.4.1.)

- Fase mobile per HPLC: miscela metanolo-acqua (3.3)

- Velocità di effllusso: 1-1,5 ml/minuto

- Lunghezza d'onda di rivelazione: 265 nm

- Volume d'iniezione: 20-50 m l.

Verificare la stabilità del sistema cromatografico iniettando più volte la soluzione di taratura (3.7.3) contenente 4 m g/ml fino a ottenimento di altezze o aree del picco e tempi di ritenzione costanti.

5.6.2. Curva di taratura

Iniettare più volte ciascuna soluzione di taratura (3.7.3) e misurare le altezze (aree) del picco per ciascuna concentrazione. Tracciare una curva di taratura riportando in ordinate l'altezza media o l'area media dei picchi delle soluzioni di taratura e in ascisse le corrispondenti concentrazioni in μg/ml.

5.6.3. Soluzione del campione

Iniettare più volte l'estratto del campione (5.5) utilizzando lo stesso volume usato per le soluzioni di taratura e determinare l'altezza (area) media dei picchi del metilbenzoquato.

6. Calcolo dei risultati

Determinare la concentrazione della soluzione del campione in g/ml in base all'altezza (area) media dei picchi del metilbenzoquato, per riferimento alla curva di taratura (5.6.2).

Il contenuto di metilbenzoquato w (mg/kg) del campione è dato dalla formula seguente:

w = (c x (40 / m))

dove

c = concentrazione del metilbenzoquato nella soluzione del campione in g/ml

m = peso della quantità di sostanza da analizzare, in grammi.

7. Convalida dei risultati

7.1. Identità

L'identità dell'analita può essere confermata mediante co-cromatografia oppure mediante un rivelatore a serie di diodi che permetta di confrontare gli spettri dell'estratto del campione e della soluzione di taratura (3.7.3) contenente 10 m g/ml.

7.1.1. Co - cromatografia

Un estratto del campione viene "rinforzato" mediante un quantitativo adeguato della soluzione standard intermedia (3.7.2). Il quantitativo di metilbenzoquato addizionato deve essere analogo a quello stimato di metilbenzoquato rilevato nell'estratto del campione.

Deve aumentare soltanto l'altezza del picco del metilbenzoquato, tenuto conto sia della quantità di metilbenzoquato aggiunta che della diluizione dell'estratto. L'ampiezza del picco, a metà della sua altezza massima, deve corrispondere, con uno scostamento massimo del 10%, all'ampiezza originale.

7.1.2. Rivelazione a serie di diodi

I risultati sono valutati in base ai seguenti criteri:

a) la lunghezza d'onda di assorbimento massimo degli spettri del campione e dello standard, registrata all'apice del picco sul cromatogramma, deve essere la stessa entro un margine determinato dal potere di risoluzione del sistema di rivelazione. Per la rivelazione a serie di diodi, tale margine è in genere di circa 2 nm;

b) fra 225 e 300 nm, gli spettri del campione e dello standard registrati all'apice del picco sul cromatogramma non devono differire tra loro per le parti dello spettro situate fra il 10 e il 100% dell'assorbanza relativa.

Questo criterio è soddisfatto quando sono presenti gli stessi valori massimi e quando in tutti i punti osservati lo scarto tra i due spettri non supera il 15% dell'assorbanza dell'analita standard;

c) tra 220 e 350 nm, gli spettri relativi all'estratto del campione, registrati nel tratto ascendente, all'apice e nel tratto discendente del picco cromatografico, non devono differire tra loro per le parti dello spettro situate fra il 10 e il 100% dell'assorbanza relativa. Questo criterio è soddisfatto quando sono presenti gli stessi valori massimi e quando in tutti i punti osservati lo scarto fra gli spettri non supera il 15% dell'assorbanza dello spettro al vertice del picco.

Se uno di questi criteri non è soddisfatto, la presenza dell'analita non è confermata.

7.2. Ripetibilità

La differenza tra i risultati di due determinazioni effettuate in parallelo sullo stesso campione non deve superare: il 10% del valore ottenuto più elevato per contenuti di metilbenzoquato compresi tra 4 e 20 mg/kg.

7.3. Recupero

Per il campione bianco addizionato, il recupero non è inferiore al 90%.

8. Risultati di uno studio collaborativo

Cinque campioni sono stati analizzati da 10 laboratori. Ogni campione è stato analizzato due volte.

NR = non riscontrata

s_r = deviazione standard della ripetibilità

CV_r = coefficiente di variazione della ripetibilità,%

S_R = deviazione standard della riproducibilità

CV_R = coefficiente di variazione della riproducibilità,%

B. DETERMINAZIONE DELL'OLAQUINDOX

2-[N-2'-(idrossietil) carbamoil]-3-metilchinoxalin-N1,N4-biossido

1. Finalità e campo d'applicazione

Il metodo consente di determinare il contenuto di olaquindox negli alimenti per animali. Il limite di quantificazione è di 5 mg/kg.

2. Principio

Il campione viene estratto con una miscela acqua/metanolo. Il tenore di olaquindox è determinato mediante cromatografia liquida ad alta prestazione (HPLC) a fase inversa, utilizzando un rivelatore UV.

3. Reattivi

3.1. Metanolo

3.2. Metanolo, di qualità HPLC

3.3. Acqua, di qualità HPLC

3.4. Fase mobile per HPLC

Miscela acqua (3.3)-metanolo (3.2), 900 + + 100 (v + v)

3.5. Sostanza di riferimento (standard): olaquindox puro: 2-[N-2'-(idrossietil)carbamoil]-3-metilchinossalina-N1,N4- biossido, E 851.

3.5.1. Soluzione madre standard di olaquindox, 250 m g / m l

Pesare, con l'approssimazione di 0,1 mg, 50 mg di olaquindox (3.5) in un matraccio tarato da 200 ml ed aggiungere circa 190 ml di acqua. Immergere quindi il matraccio per 20 minuti in un bagno ultrasonico (4.1). Dopo il trattamento ultrasonico raffreddare la soluzione a temperatura ambiente, portare a volume con acqua e mescolare. Avvolgere il matraccio in un foglio di alluminio e conservare in frigorifero. La soluzione va preparata di fresco ogni mese.

3.5.2. Soluzione standard intermedia di olaquindox, 25 μg / m l.

Travasare 10,0 ml di soluzione madre standard (3.5.1) in un matraccio tarato da 100 ml, portare a volume con la fase mobile (3.4) ed agitare. Avvolgere il matraccio in un foglio di alluminio e conservare in frigorifero. La soluzione va preparata di fresco quotidianamente.

3.5.3. Soluzioni di taratura

In una serie di matracci tarati da 50 ml trasferire 1,0, 2,0, 5,0, 10,0, 15,0 e 20,0 ml della soluzione standard intermedia (3.5.2). Portare a volume con la fase mobile (3.4) e miscelare. Avvolgere il pallone in foglio di alluminio. Queste soluzioni corrispondono rispettivamente a 0,5, 1,0, 2,5, 5,0, 7,5 e 10,0 μg/ml di olaquindox.

Queste soluzioni vanno preparate di fresco quotidianamente.

4. Apparecchiatura

4.1. Bagno ultrasonico

4.2. Agitatore meccanico

4.3. Apparecchiatura HPLC con rivelatore UV, a lunghezza d'onda variabile, oppure con rivelatore a serie diodi

4.3.1. Colonna per cromatografia liquida, da 250 mm x 4 mm, C18, particelle di riempimento 10 μm, o equivalente

4.4. Filtri a membrana, da 0,45 μm.

5. Procedimento

Nota: L'olaquindox è fotosensibile. Effettuare tutte le operazioni in luce soffusa, oppure usare vetreria scura.

5.1. Indicazioni generali

5.1.1. Analizzare un alimento di riferimento (bianco), per accertare l'assenza di olaquindox o di altre sostanze che possono interferire.

5.1.2. Effettuare una prova di recupero analizzando il bianco addizionato di una quantità di olaquindox analoga a quella presente nel campione. Per ottenere una concentrazione di 50 mg/kg, trasferire 10,0 ml della soluzione madre standard (3.5.1) in una beuta da 250 ml e far evaporare la soluzione a circa 0,5 ml. Aggiungere 50 g del bianco, mescolare il tutto e attendere 10 minuti, agitando più volte, prima di procedere all'estrazione (5.2).

Nota: Ai fini del presente metodo, il bianco ha una composizione simile a quella del campione e all'analisi l'olaquindox non deve risultare presente.

5.2. Estrazione

Pesare, con l'approssimazione di 0,01 g, 50 g circa del campione. Trasferire in una beuta da 1.000 ml, aggiungere 100 ml di metanolo (3.1) e immergere per 5 minuti la beuta in un bagno ultrasonico (4.1). Aggiungere 410 ml di acqua e lasciare nel bagno ultrasonico per altri 15 minuti. Togliere la beuta dal bagno, agitare per 30 minuti mediante l'agitatore (4.2) e filtrare attraverso un filtro a pieghe. Trasferire 10,0 ml del filtrato in un matraccio tarato da 20 ml, portare a volume con acqua e agitare. Filtrare un'aliquota attraverso un filtro a membrana (4.4). (cfr. osservazione al punto 9). Procedere alla determinazione HPLC (5.3).

5.3. Determinazione HPLC

5.3.1. Parametri:

Le seguenti condizioni vengono proposte a titolo indicativo; è possibile operare in condizioni diverse, purché si ottengano risultati equivalenti.

Colonna analitica (4.3.1)

Verificare la stabilità del sistema cromatografico iniettando più volte la soluzione di taratura (3.5.3) contenente 2,5 μg/ml, fino a ottenimento di altezze del picco e tempi di ritenzione costanti.

5.3.2. Curva di taratura

Iniettare più volte ciascuna soluzione di taratura (3.5.3) e determinare le altezze (le aree) medie dei picchi per ciascuna concentrazione. Tracciare una curva di taratura indicando le altezze (aree) medie dei picchi delle soluzioni di taratura sulle ordinate e le concentrazioni corrispondenti in μg/ml nelle ascisse.

5.3.3. Soluzione del campione

Iniettare più volte l'estratto del campione (5.2) utilizzando lo stesso volume usato per le soluzioni di taratura e determinare l'altezza (area) media dei picchi dell'olaquindox.

6. Calcolo dei risultati

Determinare la concentrazione della soluzione del campione in μg/ml in base all'altezza (area) media dei picchi dell'olaquindox, per riferimento alla curva di taratura (5.3.2).

Il tenore w di olaquindox, espresso in mg/kg del campione, è dato dalla seguente formula:

w = ((c x 1000) x m)

dove

c = concentrazione di olaquindox nell'estratto del campione (5.2) espressa in μg/ml

m = peso della sostanza da analizzare in g (5.2).

7. Convalida dei risultati

7.1. Identità

L'identità dell'analita può essere confermata mediante co-cromatografia, oppure mediante un rivelatore a serie di diodi che permetta di confrontare gli spettri dell'estratto del campione (5.2) e della soluzione di taratura (3.7.3) contenente 5,0 μg/ml.

7.1.1. Co - cromatografia

Un estratto del campione (5.2) viene "rinforzato" mediante aggiunta di un quantitativo adeguato della soluzione di taratura (3.5.3). Il quantitativo di olaquindox aggiunto deve essere simile a quello di olaquindox rilevato nell'estratto del campione.

Deve aumentare soltanto l'altezza del picco dell'olaquindox, tenuto conto sia della quantità aggiunta che della diluizione dell'estratto. L'ampiezza del picco, a metà della sua altezza, deve corrispondere, con uno scostamento massimo del 10%, all'ampiezza originale del picco dell'olaquindox nell'estratto del campione non addizionato.

7.1.2. Rivelazione a serie di diodi

I risultati sono valutati in base ai seguenti criteri:

a) la lunghezza d'onda di assorbimento massimo degli spettri del campione e dello standard, registrata all'apice del picco sul cromatogramma, deve essere la stessa entro un margine determinato dal potere di risoluzione del sistema di rivelazione. Per la rivelazione a serie di diodi, tale margine è in genere di circa 2 nm;

b) fra 220 e 400 nm, gli spettri del campione e dello standard registrati all'apice del picco sul cromatogramma non devono essere diversi per le parti dello spettro situate fra il 10 e il 100% dell'assorbanza relativa.

Questo criterio è soddisfatto quando sono presenti gli stessi valori massimi e quando in tutti i punti osservati lo scarto tra i due spettri non supera il 15% dell'assorbanza dell'analita standard;

c) fra 220 e 400 nm, gli spettri relativi all'estratto del campione, registrati nel tratto ascendente, all'apice e nel tratto discendente del picco cromatografico, non devono differire tra loro per le parti dello spettro situate fra il 10 e il 100% dell'assorbanza relativa. Questo criterio è soddisfatto quando sono presenti gli stessi valori massimi e quando in tutti i punti osservati lo scarto tra gli spettri non supera il 15% dell'assorbanza dello spettro al vertice del picco.

Se uno di questi criteri non è soddisfatto, la presenza dell'analita non è confermata.

7.2. Ripetibilità

La differenza tra i risultati di due determinazioni effettuate in parallelo sullo stesso campione non deve superare il 15% del risultato più elevato per contenuti di olaquindox compresi tra 10 e 200 mg/kg.

7.3. Recupero

Per il campione bianco addizionato, il recupero non è inferiore al 90%.

8. Risultati di uno studio collaborativo

E' stato organizzato uno studio comunitario in cooperazione tra vari laboratori nel corso del quale tredici laboratori hanno analizzato quattro campioni di alimenti per suinetti, ivi compreso un alimento bianco. I risultati dello studio figurano nella tabella seguente:

L = numero di laboratori

n = numero di valori singoli

S_r = deviazione standard della ripetibilità

S_R = deviazione standard della riproducibilità

CV_r = coefficiente di variazione della ripetibilità

CV_R = coefficiente di variazione della riproducibilità

9. Osservazione

Anche se il metodo non è stato convalidato per alimenti contenenti quantità superiori a 100 mg/kg di olaquindox, è possibile ottenere risultati soddisfacenti pesando una quantità di campione più piccola e/o diluendo l'estratto (5.2) fino a ottenere una concentrazione entro il campo della curva di taratura.

C. DETERMINAZIONE DELL'AMPROLIUM

Cloridrato di cloruro di 1-[(4-ammino-2-propil-5 pirimidinil)metil]-2-picolinio

1. Finalità e campo d'applicazione

Il metodo consente di determinare il contenuto di amprolium negli alimenti per animali e nelle premiscele. Il limite di rilevazione è di 1 mg/kg, la soglia di quantificazione è di 5 mg/kg.

2. Principio

Il campione è estratto con una miscela metanolo/acqua. Dopo diluizione con la fase mobile e filtrazione per membrana, il contenuto di amprolium è determinato per cromatografia in fase liquida ad alta prestazione (HPLC) a scambio cationico, utilizzando un rivelatore UV.

3. Reattivi

3.1. Metanolo

3.2. Acetonitrile, di qualità HPLC

3.3. Acqua, di qualità HPLC

3.4. Soluzione di fosfato monosodico, c = 0,1 mol/1

In un matraccio tarato da 1.000 ml, sciogliere 13,80 g di fosfato monosodico monoidrato in acqua (3.3), portare a volume con acqua (3.3) e mescolare.

3.5. Soluzione di perclorato sodico, c = 1,6 mol/1 In un matraccio tarato da 1.000 ml, sciogliere 224,74 g di perclorato sodico monoidrato in acqua (3.3), portare a volume con acqua (3.3) e mescolare.

3.6. Fase mobile per HPLC (cfr. osservazione 9.l)

Miscela di acetonitrile (3.2), soluzione di fosfato monosodico (3.4) e soluzione di perclorato sodico (3.5), 450+450+100 (v+v+v). Prima dell'impiego, filtrare attraverso filtro a membrana da 0,22 μm (4.3) e degassare la soluzione [ad esempio nel bagno ultrasonico (4.4), per almeno 15 minuti].

3.7. Sostanza di riferimento (standard): cloridrato di cloruro di 1-[(4-ammino-2-propilpirimidin5-il)metil]-2-metilpiridinio (amprolium, E 750), di purezza garantita (cfr. punto 9.2).

3.7.1. Soluzione madre standard di amprolium, 500 μg / m l

In un matraccio tarato da 100 ml, pesare, con l'approssimazione di 0,1 mg, 50 mg di amprolium (3.7); sciogliere in 80 ml di metanolo (3.l) e immergere per 10 minuti il matraccio in bagno ultrasonico (4.4). Dopo il trattamento a ultrasuoni raffreddare la soluzione a temperatura ambiente, portare a volume con acqua e mescolare. A temperatura non superiore a 4 oC la soluzione si mantiene stabile per un mese.

3.7.2. Soluzione standard intermedia di amprolium, 50 μg / m l.

In un matraccio tarato da 50 ml, pipettare 5,0 ml della soluzione madre standard (3.7.l), portare a volume col solvente di estrazione (3.8) e mescolare. A temperatura non superiore a 4°C la soluzione si mantiene stabile per un mese.

3.7.3. Soluzioni di taratura

Trasferire 0,5, 1,0 e 2,0 ml della soluzione standard intermedia (3.7.2) in una serie di matracci tarati da 50 ml.

Portare a volume con la fase mobile (3.6) e miscelare. Queste soluzioni corrispondono rispettivamente a 0,5, 1,0 e 2,0 μg/ml di amprolium. Esse vanno preparate al momento, prima dell'uso.

3.8. Solvente di estrazione

Miscela metanolo (3.l)-acqua 2+1 (v+v)

4. Apparecchiatura

4.1. Apparecchiatura HPLC con sistema di iniezione adeguato per volumi da 100 μl.

4.1.1. Colonna per cromatografia liquida, 125 mm x 4 mm, a scambio cationico (riempimento: Nucleosil 10 SA, 5 o 10 μm) o equivalente.

4.1.2. Rivelatore UV a lunghezza d'onda variabile o rivelatore a serie di diodi

4.2. Filtro a membrana in PTFE, da 0,45 μm.

4.3. Filtro a membrana, da 0,22 μm

4.4. Bagno ultrasonico

4.5. Agitatore meccanico o magnetico

5. Procedimento

5.1. Indicazioni generali

5.1.1. Alimento "bianco"

Per poter procedere alla prova di recupero (5.l.2) analizzare un alimento di riferimento (bianco), per accertare l'assenza di amprolium o di altre sostanze che possono interferire. L'alimento bianco ha una composizione simile a quella del campione e all'analisi l'amprolium o sostanze capaci di interferire non devono risultare presenti.

5.1.2 Prova di recupero

Effettuare una prova di recupero analizzando il bianco addizionato di una quantità di amprolium simile a quella presente nel campione. Per ottenere una concentrazione di 100 mg/kg, trasferire 10,0 ml della soluzione madre standard (3.7.1) in una beuta da 250 ml e far evaporare la soluzione a circa 0,5 ml. Aggiungere 50 g del bianco, mescolare il tutto e attendere per 10 minuti, agitando più volte, prima di procedere all'estrazione (5.2).

Se non fosse disponibile un bianco di tipo simile a quello del campione (cfr. punto 5.1.1), la prova di recupero può essere eseguita col metodo di addizione della sostanza di riferimento. In questo caso, un'aliquota del campione da analizzare viene addizionata di una quantità nota di amprolium, analoga a quella già presente.

Quest'aliquota viene analizzata insieme a una del campione non addizionato e il recupero può essere calcolato per differenza.

5.2. Estrazione

5.2.1. Premiscele (contenuto < 1% di amprolium) e alimenti per animali

A seconda del contenuto di amprolium, pesare, con l'approssimazione di 0,01 g, da 5 g a 40 g di campione in una beuta da 500 ml a fondo conico e aggiungere 200 ml di solvente di estrazione (3.8). Collocare la beuta nel bagno ultrasonico (4.4) e mantenervela per 15 minuti. Togliere la beuta dal bagno, agitare per un'ora mediante l'agitatore o col mescolatore magnetico (4.5). Diluire una parte di estratto con la fase mobile (3.6) sino ad ottenere un tenore di amprolium di 0,5-2 μg/ml e mescolare (cfr. osservazione 9.3). Filtrare 5-10 ml di questa soluzione diluita attraverso un filtro a membrana (4.2). Procedere alla determinazione HPLC (5.3).

5.2.2. Premiscele (contenuto ≥ 1% di amprolium)

A seconda del contenuto di amprolium, pesare, con l'approssimazione di 0,001 g, da 1 a 4 g di premiscela in una beuta da 500 ml e aggiungere 200 ml di solvente di estrazione (3.8). Collocare la beuta nel bagno ultrasonico (4.4) e mantenervela per 15 minuti. Togliere la beuta dal bagno, agitare per un'ora mediante l'agitatore o col mescolatore magnetico (4.5). Diluire una parte di estratto con la fase mobile (3.6) sino ad ottenere un contenuto di amprolium di 0,5-2 μg/ml e mescolare. Filtrare 5-10 ml di questa soluzione diluita attraverso un filtro a membrana (4.2). Procedere alla determinazione HPLC (5.3).

5.3. Determinazione HPLC

5.3.1. Parame tri:

Le seguenti condizioni vengono proposte a titolo indicativo; è possibile operare in condizioni diverse, purché si ottengano risultati equivalenti.

Verificare la stabilità del sistema cromatografico iniettando varie volte la soluzione di taratura (3.7.3) contenente 1,0 μg/ml, fino a ottenimento di altezze del picco e tempi di ritenzione costanti.

5.3.2. Curva di taratura

Iniettare più volte ciascuna soluzione di taratura (3.7.3) e determinare le altezze (aree) medie del picco per ciascuna concentrazione. Tracciare una curva di taratura indicando le altezze (aree) medie del picco delle soluzioni di taratura sulle ordinate e le concentrazioni corrispondenti in μg/ml nelle ascisse.

5.3.3. Soluzione del campione

Iniettare più volte l'estratto del campione (5.2), utilizzando lo stesso volume di quello prelevato per le soluzioni di taratura e determinare le altezze (aree) medie del picco dell'amprolium.

6. Calcolo dei risultati

Determinare la concentrazione della soluzione del campione in μg/ml in base all'altezza (area) media dei picchi dell'amprolium, per riferimento alla curva di taratura (5.3.2).

Il contenuto w di amprolium nel campione, espresso in mg/kg, è dato dalla seguente formula:

w = ((V x c x f) / m)) [mg/kg]

dove

V = volume del solvente di estrazione (3.8) espresso in ml conformemente al punto 5.2 (ossia 200 ml)

c = concentrazione di amprolium nell'estratto del campione (5.2) espresso in μg/m

f = fattore di diluizione conformemente al punto 5.2.2

m = peso della quantità di sostanza da analizzare, in grammi.

7. Convalida dei risultati

7.1. Identità

L'identità dell'analita può essere confermata mediante co-cromatografia oppure mediante un rivelatore a serie di diodi che permetta di confrontare gli spettri dell'estratto del campione (5.2) e della soluzione di taratura (3.7.3) contenente 2,0 μg/ml.

7.1.1. Co - cromatografia

Un estratto del campione (5.2) viene "rinforzato" mediante aggiunta di un quantitativo adeguato della soluzione di taratura (3.7.3). Il quantitativo di amprolium aggiunto deve essere simile a quello di amprolium rilevato nell'estratto del campione.

Deve aumentare soltanto l'altezza del picco dell'amprolium, tenuto conto sia del quantitativo aggiunto che della diluizione dell'estratto. L'ampiezza del picco, a metà della sua altezza, deve corrispondere, con uno scostamento massimo del 10%, all'ampiezza originale del picco dell'amprolium nell'estratto del campione non addizionato.

7.1.2. Rivelazione a serie di diodi

I risultati sono valutati in base ai seguenti criteri:

a) la lunghezza d'onda dell'assorbimento massimo degli spettri del campione e dello standard, registrata al vertice del picco sul cromatogramma, deve essere la stessa entro un margine determinato dal potere di risoluzione del sistema di rivelazione. Per la rivelazione a serie di diodi, tale margine è in genere di circa 2 nm;

b) fra 210 e 320 nm, gli spettri del campione e dello standard registrati al vertice del picco sul cromatogramma non devono essere diversi per le parti dello spettro situate fra il 10 e il 100% dell'assorbanza relativa. Questo criterio è soddisfatto quando sono presenti gli stessi valori massimi e quando in tutti i punti osservati lo scarto fra gli spettri non supera il 15% dell'assorbanza dell'analita standard;

c) fra 210 e 320 nm, gli spettri relativi all'estratto del campione, registrati nel tratto ascendente, all'apice e nel tratto discendente del picco cromatografico, non devono differire tra loro per le parti dello spettro situate fra il 10 e il 100% dell'assorbanza relativa. Questo criterio è soddisfatto quando sono presenti gli stessi valori massimi e quando in tutti i punti osservati lo scarto fra gli spettri non supera il 15% dell'assorbanza dello spettro al vertice del picco.

Se uno di questi criteri non è soddisfatto, la presenza dell'analita non è confermata.

7.2. Ripetibilità

La differenza fra i risultati di due determinazioni effettuate in parallelo sullo stesso campione non deve superare:

- il 15% del valore più elevato, per i contenuti di amprolium compresi fra 25 mg/kg e 500 mg/kg,

- 75 mg/kg per i contenuti di amprolium compresi fra 500 mg/kg e 1 000 mg/kg,

- il 7,5% del valore più elevato, per i contenuti di amprolium superiori a 1 000 mg/kg.

7.3. Recupero

Per un campione addizionato (bianco), il recupero non è inferiore al 90%.

8. Risultati di uno studio collaborativo

E' stato organizzato uno studio in cooperazione tra vari laboratori nel corso del quale sono stati analizzati tre alimenti per pollame (campioni 1-3), un alimento minerale (campione 4) e una premiscela (campione 5). I risultati dello studio figurano nella seguente tabella:

L: numero di laboratori

n: numero di valori singoli

s_r: deviazione standard della ripetibilità

CV_r: coefficiente di variazione della ripetibilità

S_R: deviazione standard della riproducibilità

CV_R: coefficiente di variazione della riproducibilità

9. Osservazioni

9.1. Se il campione contiene tiamina, il relativo picco compare nel cromatogramma poco prima di quello dell'amprolium. Secondo questo metodo, l'amprolium e la tiamina debbono essere separati. Se l'amprolium e la tiamina non vengono separati dalla colonna (4.1.1) impiegata con questo metodo, sostituire con metanolo fino al 50% della porzione di acetonitrile della fase mobile (3.6).

9.2. Secondo la farmacopea britannica, lo spettro di una soluzione di amprolium (c = 0,02 mol/l) in acido cloridrico

(c = 0,1 mol/l) presenta valori massimi a 246 nm e 262 nm. L'assorbanza è di 0,84 a 246 nm e di 0,80 a 262 nm.

9.3. L'estratto deve essere sempre diluito con la fase mobile, poiché altrimenti il tempo di ritenzione del picco dell'amprolium potrebbe spostarsi significativamente per effetto delle variazioni della forza ionica.

D. DETERMINAZIONE DEL CARBADOX

Metil-3-(2-chinossalinilinmetilene) carbazato-N1,N4-diossido

1. Finalità e campo d'applicazione

Il metodo consente di determinare il contenuto di carbadox negli alimenti per animali, nelle premiscele e nei preparati. Il limite di rilevazione è di 1 mg/kg, la soglia di quantificazione è di 5 mg/kg.

2. Principio

Il campione viene equilibrato con acqua ed estratto con metanolo-acetonitrile. Nel caso degli alimenti per animali, un'aliquota dell'estratto filtrato è sottoposta a purificazione su una colonna di allumina. Per le premiscele e i preparati, un'aliquota dell'estratto filtrato è diluita con acqua, metanolo e aceto nitrile, fino a ottenere una concentrazione adeguata. Il contenuto di carbadox è determinato mediante cromatografia liquida ad alta prestazione (HPLC) in fase inversa, usando un rivelatore UV.

3. Reattivi

3.1. Metanolo

3.2. Acetonitrile, di qualità HPLC

3.3. Acido acetico, w = 100%

3.4. Ossido d'alluminio: neutro, grado di attività I

3.5. Metanolo-acetonitrile 1 + 1 (v + v)

Miscelare 500 ml di metanolo (3.l) con 500 ml di acetonitrile (3.2).

3.6. Acido acetico, σ = 10%

Diluire con acqua 10 ml di acido acetico (3.3) e portare a 100 ml.

3.7. Acetato di sodio

3.8. Acqua, di qualità HPLC

3.9. Soluzione tampone di acetato, c = 0,01 mol/1, pH = 6,0

Sciogliere 0,82 g di acetato di sodio (3.7) in 700 ml d'acqua (3.8) e regolare il pH a 6,0 con acido acetico (3.6).

Trasferire in un matraccio tarato da 1000 ml, portare a volume con acqua (3.8) e mescolare.

3.10. Fase mobile per HPLC

Mescolare 825 ml di soluzione tampone di acetato (3.9) con 175 ml di acetonitrile (3.2).

Filtrare la soluzione attraverso un filtro da 0,22 μm (4.5) e degassarla (ad esempio sottoponendola per 10 minuti

a trattamento con ultrasuoni).

3.11. Sostanza di riferimento (standard):

Carbadox allo stato puro: Metil-3-(2-chinossalinilinmetilene) carbazato-N1,N4-diossido, E 850

3.11.1. Soluzione madre s tandard di carbadox, 100 μg / m l (cfr. nota 5. Procedimento):

In un matraccio tarato da 250 ml, pesare, con l'approssimazione di 0,1 mg, 25 mg di carbadox standard. Sciogliere la sostanza in metanolo-acetonitrile (3.5) sottoponendola a trattamento con ultrasuoni (4.7). Dopo il trattamento con ultrasuoni, raffreddare a temperatura ambiente, portare a volume con metanolo-acetonitrile (3.5) e mescolare. Avvolgere il matraccio in un foglio d'alluminio o usare vetreria scura e conservare in frigorifero. A temperatura non superiore a 4°C la soluzione si mantiene stabile per un mese.

3.11.2. Soluzioni di taratura

Trasferire 2,0, 5,0, 10,0 e 20,0 ml della soluzione madre standard (3.11.1) in una serie di matracci tarati da 100 ml. Aggiungere 30 ml d'acqua, portare a volume con metanolo-acetonitrile (3.5) e mescolare. Avvolgere i matracci in foglio d'alluminio. Queste soluzioni corrispondono rispettivamente a 2,0, 5,0, 10,0 e 20,0 μg/ml di carbadox.

Le soluzioni di taratura devono essere preparate al momento, poco prima dell'uso.

Nota: per la determinazione del carbadox negli alimenti per animali contenenti meno di 10 mg/kg si dovranno preparare soluzioni di taratura a concentrazioni inferiori a 2,0 μg/ml.

3.12. Miscela acqua -[metanolo-acetonitrile] (3.5), 300 + 700 (v + v).

Mescolare 300 ml d'acqua con 700 ml della miscela di metanolo-acetonitrile (3.5).

4. Apparecchiatura

4.1. Agitatore da laboratorio o mescolatore magnetico

4.2. Carta da filtro in fibra di vetro (Whatman GF/A o equivalente)

4.3. Colonna in vetro (lunghezza: 300-400 mm, diametro interno: 10 mm circa), con setto in vetro sinterizzato e valvola di scarico.

Nota: Si può anche impiegare una colonna di vetro provvista di rubinetto oppure una colonna di vetro a estremità affusolata. In questo caso, si deve inserire un piccolo tampone di lana di vetro all'estremità inferiore e pressarlo verso il basso con una bacchetta di vetro.

4.4. Apparecchiatura HPLC con sistema di iniezione adeguato per volumi da 20 μl.

4.4.1. Colonna per cromatografia liquida: 300 mm x 4 mm, C18, particelle di riempimento 10 μm, o equivalente

4.4.2. Rivelatore UV con regolazione variabile della lunghezza d'onda o rivelatore a serie di diodi, funzionante nell'intervallo di 225-400 nm.

4.5. Filtro a membrana, da 0,22 μm.

4.6. Filtro a membrana, da 0,45 μm.

4.7. Bagno ultrasonico

5. Procedimento

Nota: Il carbadox è fotosensibile. Effettuare tutte le operazioni in luce soffusa oppure usare vetreria scura o

avvolta in foglio d'alluminio.

5.1. Indicazioni generali

5.1.1. Alimento "bianco"

Per poter procedere alla prova di recupero (5.l.2) analizzare un alimento di riferimento (bianco), per accertare l'assenza di carbadox o di altre sostanze che possono interferire. Il bianco ha una composizione simile a quella del campione e all'analisi il carbadox o sostanze capaci di interferire non devono risultare presenti.

5.1.2. Prova di recupero

Effettuare una prova di recupero analizzando il bianco (5.1.1) addizionato di una quantità di carbadox simile a quella presente nel campione. Per ottenere una concentrazione di 50 mg/kg, introdurre 5,0 ml della soluzione madre standard (3.11.1) in una beuta da 200 ml. Far evaporare la soluzione a 0,5 ml circa, in corrente di azoto. Aggiungere 10 g dell'alimento bianco, mescolare per 10 minuti prima di procedere all'estrazione (5.2).

Se non fosse disponibile un bianco di tipo simile a quello del campione (cfr. punto 5.1.1), la prova di recupero può essere eseguita col metodo di addizione della sostanza di riferimento. In questo caso, un'aliquota del campione da analizzare viene addizionata di una quantità nota di carbadox, analoga a quella già presente. Quest'aliquota viene analizzata insieme a una del campione non addizionato e il recupero può essere calcolato per differenza.

5.2. Estrazione

5.2.1. Alimenti per animali

Pesare, con l'approssimazione di 0,01 g, 10 g del campione e trasferirli in una beuta da 200 ml. Aggiungere 15,0 ml di acqua, mescolare ed equilibrare per 5 minuti. Aggiungere 35,0 ml di metanolo-acetonitrile (3.5), tappare e agitare per 30 minuti sull'agitatore o col mescolatore magnetico (4.l). Filtrare la soluzione attraverso carta da filtro in fibra di vetro (4.2). Conservare questa soluzione per la fase di purificazione (5.3).

5.2.2. Premiscele (0, 1 - 2, 0%)

Pesare, con l'approssimazione di 0,001 g, 1 g del campione non macinato e trasferirlo in una beuta da 200 ml.

Aggiungere 15,0 ml di acqua, mescolare ed equilibrare per 5 minuti. Aggiungere 35,0 ml di metanoloacetonitrile (3.5), tappare ed agitare per 30 minuti sull'agitatore o col mescolatore magnetico (4.l). Filtrare la soluzione attraverso carta da filtro in fibra di vetro (4.2).

Pipettare un'aliquota del filtrato in un matraccio tarato da 50 ml. Aggiungere 15,0 ml d'acqua, portare a volume con metanolo-acetonitrile (3.5) e mescolare. La concentrazione di carbadox nella soluzione finale è di circa 10 g/ml. Filtrare un'aliquota attraverso un filtro a membrana da 0,45 μm (4.6).

Procedere alla determinazione HPLC (5.4).

5.2.3. Preparati ( > 2%)

Pesare, con l'approssimazione di 0,001 g, 0,2 g del campione non macinato e trasferirli in una beuta da 250 ml. Aggiungere 45,0 ml d'acqua, mescolare ed equilibrare per 5 minuti. Aggiungere 105,0 ml di metanoloacetonitrile (3.5), coprire e omogeneizzare. Sottoporre il campione a ultrasuoni (4.7) per 15 minuti, poi scuotere o agitare per 15 minuti (4.1). Filtrare la soluzione attraverso carta da filtro in fibra di vetro (4.2).

Diluire un'aliquota del filtrato con la miscela acqua-metanolo-acetonitrile (3.12) fino ad ottenere una concentrazione finale di carbadox dell'ordine di 10-15 μg/ml (per un preparato al 10%, il fattore di diluizione θ 10). Filtrare un'aliquota attraverso un filtro da 0,45 μm (4.6).

Procedere alla determinazione HPLC (5.4).

5.3. Purificazione

5.3.1. Preparazione della colonna diossido di alluminio

Pesare 4 g di ossido di alluminio (3.4) e trasferire nella colonna di vetro (4.3).

5.3.2. Purificazione del campione

Far passare 15 ml dell'estratto filtrato (5.2.1) per la colonna di ossido di alluminio ed eliminare i primi 2 ml di eluato. Raccogliere i successivi 5 ml e filtrare un'aliquota attraverso un filtro da 0,45 μm (4.6).

Procedere alla determinazione HPLC (5.4).

5.4. Determinazione HPLC

5.4.1. Parametri

Le seguenti condizioni sono proposte a titolo indicativo; è possibile operare in condizioni diverse purché si ottengano risultati equivalenti.

Verificare la stabilità del sistema cromatografico iniettando più volte la soluzione di taratura (3.11.2) contenente 5,0 μg/ml, fino a ottenimento di altezze del picco e tempi di ritenzione costanti.

5.4.2. Curva di taratura

Iniettare più volte ciascuna soluzione di taratura (3.11.2) e determinare le altezze (aree) del picco per ciascuna concentrazione. Tracciare una curva di taratura riportando in ordinata le altezze (aree) medie del picco della soluzione di taratura e in ascissa le corrispondenti concentrazioni, espresse in μg/ml.

5.4.3. Soluzione del campione

Iniettare più volte l'estratto del campione [(5.3.2) per gli alimenti, (5.2.2) per le premiscele e (5.2.3) per i preparati], e determinare l'altezza (area) media dei picchi del carbadox.

6. Calcolo dei risultati

Determinare la concentrazione della soluzione del campione in μg/ml in base all'altezza (area) media dei picchi del carbadox, per riferimento alla curva di taratura (5.4.2).

6.1. Alimenti per animali

Il contenuto w (mg/kg) di carbadox nel campione è dato dalla seguente formula:

w = ((c x V₁) / m) [mg/kg]

dove

c = concentrazione di carbadox nell'estratto del campione (5.2) espresso in μg/ml

V₁ = volume dell'estratto espresso in ml (ossia 50 ml)

m = peso della quantità di sostanza da analizzare, in grammi.

6.2. Premiscele e preparati

Il contenuto w (mg/kg) di carbadox nel campione è dato dalla seguente formula:

w = ((c x V₂ x f) / m) [mg/kg]

dove

c = concentrazione di carbadox nell'estratto del campione (5.2.2 o 5.2.3) espresso in μg/ml

V₂ = volume dell'estratto espresso in ml (ossia 50 ml per le premiscele;) 150 ml per i preparati)

f = fattore di diluizione conformemente ai punti 5.2.2 (premiscele) e 5.2.3 (preparati)

m = peso della quantità di sostanza da analizzare, in grammi.

7. Convalida dei risultati

7.1. Identità

L'identità dell'analita può essere confermata mediante co-cromatografia oppure mediante un rivelatore a serie di diodi che permetta di confrontare gli spettri dell'estratto del campione e della soluzione di taratura (3.11.2) contenente 10,0 μg/ml.

7.1.1. Co - cromatografia

Un estratto del campione viene "rinforzato" mediante aggiunta di un quantitativo adeguato della soluzione di taratura (3.11.2). Il quantitativo di carbadox aggiunto deve essere simile a quello stimato rilevato nell'estratto del campione.

Deve aumentare soltanto l'altezza del picco del carbadox tenuto conto sia del quantitativo di carbadox aggiunto che della diluizione dell'estratto. L'ampiezza del picco, a metà della sua altezza massima, deve corrispondere, con uno scostamento massimo del 10%, dall'ampiezza originale.

7.1.2. Rivelazione a serie di diodi

I risultati sono valutati in base ai seguenti criteri:

a) la lunghezza d'onda dell'assorbimento massimo degli spettri del campione e dello standard, registrata al vertice del picco sul cromatogramma, deve essere la stessa entro un margine determinato dal potere di risoluzione del sistema di rivelazione. Per la rivelazione a serie di diodi, tale margine è in genere di circa 2 nm;

b) fra 225 e 400 nm, gli spettri del campione e dello standard registrati all'apice del picco cromatografico non devono differire tra loro per le parti dello spettro situate fra il 10% e il 100% dell'assorbanza relativa. Questo criterio è soddisfatto quando sono presenti gli stessi valori massimi e quando in tutti i punti osservati lo scarto tra gli spettri non supera il 15% dell'assorbanza dell'analita standard;

c) fra 225 e 400 nm, gli spettri relativi all'estratto del campione, registrati nel tratto ascendente, all'apice e nel tratto discendente del picco cromatografico, non devono differire tra loro per quelle parti dello spettro situate tra il 10 e il 100% dell'assorbanza relativa. Questo criterio è soddisfatto quando sono presenti gli stessi valori massimi e quando in tutti i punti osservati lo scarto tra gli spettri non supera il 15% dell'assorbanza dello spettro all'apice del picco.

Se uno di questi criteri non è soddisfatto, la presenza dell'analita non è confermata.

7.2. Ripetibilità

Per contenuti di 10 mg/kg e superiori, la differenza fra i risultati di due determinazioni effettuate in parallelo sullo stesso campione non deve superare il 15% rispetto al risultato più elevato.

7.3. Recupero

Per un campione addizionato (bianco), il recupero non è inferiore al 90%.

8. Risultati di uno studio collaborativo

E' stato organizzato uno studio in cooperazione tra vari laboratori nel corso del quale otto laboratori hanno analizzato sei alimenti per animali, quattro premiscele e tre preparati. Ogni campione è stato analizzato due volte. (Per maggiori informazioni consultare: Journal of the AOAC, Volume 71, 1998, pag. 484-490). I risultati (ad esclusione di quelli fuori campo) sono mostrati di seguito:

Tabella 1.

Risultati dello studio collaborativo sugli alimenti per animali

Tabella 2.

Risultati dello studio collaborativo sulle premiscele e sui preparati

L: numero di laboratori

n: numero di valori singoli

S_r: deviazione standard della ripetibilità

CV_r: coefficiente di variazione della ripetibilità

S_R: deviazione standard della riproducibilità

CV_R: coefficiente di variazione della riproducibilità]

TAVOLE DI CONCORDANZA DI CUI ALL'ARTICOLO 6

1. Direttiva 71/250/CEE

2. Direttiva 71/393/CEE

3. Direttiva 72/199/CEE

4. Direttiva 73/46/CEE

5. Direttiva 76/371/CEE

6. Direttiva 76/372/CEE

7. Direttiva 78/633/CEE

8. Direttiva 81/715/CEE

9. Direttiva 84/425/CEE

10. Direttiva 86/174/CEE

11. Direttiva 93/70/CEE

12. Direttiva 93/117/CE

13. Direttiva 98/64/CE

14. Direttiva 1999/27/CE

15. Direttiva 1999/76/CE

16. Direttiva 2000/45/CE

17. Direttiva 2002/70/CE

18. Direttiva 2003/126/CE